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Jun 18, 2023

Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5375 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Presentamos un método simple para producir pseudovesículas lipídicas gigantes (vesículas con una tapa aceitosa en la parte superior), atrapadas en un gel de agarosa. El método se puede implementar usando solo una micropipeta normal y se basa en la formación de una gota doble de agua/aceite/agua en agarosa líquida. Caracterizamos la vesícula producida con imágenes de fluorescencia y establecemos la presencia e integridad de la bicapa lipídica mediante la inserción exitosa de proteínas transmembrana \(\alpha \)-hemolisina. Finalmente, mostramos que la vesícula se puede deformar fácilmente mecánicamente, de forma no intrusiva, al indentar la superficie del gel.

Las vesículas se han utilizado ampliamente para imitar la compartimentación celular y reproducir funciones biológicas específicas in vitro con enfoques ascendentes1,2. En muchos estudios recientes, la atención se centró en la encapsulación de reacciones biológicas complejas dentro de las vesículas, para expresar proteínas3 o genes4, o para reconstituir y estudiar los filamentos de proteínas del citoesqueleto, como la corteza de actina5 o los microtúbulos aster6. Muchos otros trabajos pretenden imitar las propiedades de la membrana celular, como por ejemplo la fusión de membranas7,8,9, o la comunicación celular, mediante la inserción de proteínas transmembrana en liposomas. En particular, se han insertado canales mecanosensibles10,11 en la membrana de los liposomas, lo que a su vez permite medir su conductancia bajo estrés mecánico.

La producción de vesículas generalmente se basa en métodos de hidratación o plantillas de emulsión invertida. Los métodos de hidratación se basan en el hinchamiento de películas lipídicas secas en un tampón acuoso12,13. Son relativamente simples de operar pero producen tamaños de vesícula polidispersos y una eficiencia de encapsulación relativamente no homogénea14,15,16. La tasa de producción de vesículas unilamelares se puede mejorar mediante el uso de campos eléctricos (métodos de electroformación17), pero los campos aplicados pueden dañar las frágiles proteínas18,19 y la técnica también se limita a tampones con bajas concentraciones iónicas. Las plantillas de emulsión invertida, por otro lado, se basan en el paso forzado de gotas de una emulsión de agua en aceite a través de una interfaz de agua/aceite5,20. Este método se puede desarrollar en chips microfluídicos21,22,23,24, lo que produce tamaños de vesículas monodispersos, que están limitados por las dimensiones del canal microfluídico.

En ambos métodos (hidratación o emulsiones), las vesículas resultantes se dispersan en el medio exterior, lo que requiere pasos adicionales para manipularlas o transferirlas en diferentes ambientes (micropipetas25, trampeo óptico26, etc). Estos pasos adicionales, que se basan en habilidades técnicas específicas, dificultan la replicación de muchos experimentos y la recopilación de grandes estadísticas sobre las propiedades de los sistemas. En particular, para estudiar los procesos de mecanotransducción, se requiere estimular mecánicamente las vesículas. En la práctica, esto se ha logrado típicamente con deformaciones locales de la membrana (succión de pipeta27, flujos de fluidos28,29, AFM30,31). Sin embargo, estos métodos no reproducen fielmente la naturaleza de las perturbaciones mecánicas en los tejidos. Además, pasan por alto el acoplamiento mecánico entre las células y su entorno biológico viscoelástico.

Proponemos aquí una nueva técnica, que proporciona una plataforma versátil para la producción sencilla de pseudo-vesículas biomiméticas (una vesícula con una tapa aceitosa en la parte superior), pero también permite su captura y excitación mecánica no intrusiva.

(a–f) (fila superior) Esquema del método de producción de doble emulsión. Los colores verde/naranja/azul representan las fases interna/aceite/externa, respectivamente. (fila inferior) Imágenes de campo claro. Barras de escala = 500 \(\mu \)m. La gota de emulsión doble producida en (f) sedimenta en la agarosa líquida y finalmente queda atrapada cuando la agarosa gelifica. Simultáneamente, la capa de aceite que la rodea forma crema en la parte superior de la gota y una bicapa lipídica se cierra en la parte inferior. Unos minutos más tarde, la pseudovesícula se ha formado y queda atrapada en el gel, como se muestra en (g). Panel inferior: imagen macroscópica de fluorescencia de una pseudovesícula cargada con carboxifluoresceína atrapada en un gel de agarosa. Barra de escala = 200 \(\mu \)m.

Las vesículas se producen a partir de agua en una configuración de gotitas de aceite que contienen lípidos, que se forma en una solución de agarosa líquida y tibia (los detalles sobre los productos químicos se pueden encontrar en la sección "Métodos"). Primero extraemos un pequeño volumen (alrededor de 500 nL) de la fase acuosa interna (Fig. 1a), usando una micropipeta de 2.5 \(\mu \)L (Eppendorf). En segundo lugar, metemos la pipeta en el recipiente de aceite/lípidos y aspiramos unos 50 nL (Fig. 1b), girando la rueda de ajuste de la micropipeta mientras la punta está sumergida en el aceite. La punta de la pipeta contiene así un sándwich de aceite/agua. Por último, movemos la pipeta a la solución de agarosa tibia (temperatura \(T\approx 38\,^{\circ }C\), ver detalles en la sección "Métodos") donde expulsamos el sándwich de aceite/agua girándolo hacia atrás. la rueda de ajuste de la micropipeta. Durante esta fase de expulsión, la fase oleosa primero se convierte en una gota en la agarosa líquida (Fig. 1c), seguida por la fase acuosa que crece en su interior (Fig. 1d, e). Finalmente, movemos rápidamente la pipeta hacia arriba en el aire, lo que separa la doble gota de la punta debido a la fricción viscosa de la solución de agarosa (Fig. 1f).

Inmediatamente después de su formación, la gota de agua interior está rodeada por una capa de aceite que contiene fosfolípidos. Por lo tanto, estos lípidos se redistribuyen en ambas interfaces agua-aceite, con sus cabezas hidrofílicas giradas hacia la fase acuosa interna por un lado y hacia la solución de agarosa por el otro lado. Mientras la solución de agarosa se enfría, la gota doble se sedimenta lentamente en la solución de agarosa y finalmente queda atrapada en el gel formado. Durante este proceso de enfriamiento, la capa de aceite de la gotita doble crece bajo la acción de la gravedad para formar una capa de aceite, mientras que los lípidos que estabilizan las antiguas interfaces aceite/agua forman una bicapa lipídica en la parte inferior de la gotita (Fig. 1g). La gota doble se convierte en una pseudovesícula. Este sencillo método de micropipeta produce pseudovesículas con un diámetro de 601 \(\pm 58 \mu \)m (N = 98). Se pueden obtener tamaños más pequeños utilizando puntas más pequeñas y un microinyector (consulte la sección "Métodos"). La tasa de producción del método es de alrededor de 5 pseudovesículas por minuto y la tasa de éxito es en general de alrededor del 30%. Una vez atrapada en el gel, la pseudovesícula es estable durante varias horas y puede conservarse durante la noche si la cubeta que contiene el gel está sellada para evitar la evaporación. Además, al estar atrapadas en el gel, las pseudovesículas se pueden observar fácilmente con un microscopio, como en32.

Para caracterizar la pseudovesícula y probar la existencia de una bicapa lipídica, primero usamos marcadores fluorescentes dispersos tanto en la fase acuosa interna (carboxifluoresceína, longitud de onda de emisión \(\lambda _c = 525\) nm, verde, ver sección "Métodos" ) y la fase de aceite (rojo Nilo, longitud de onda de emisión \(\lambda _n = 636\) nm, rojo). La pseudovesícula se produce en el gel de agarosa como se describió anteriormente y se obtienen más imágenes usando un microscopio confocal, con un objetivo de 4x. Se registran las imágenes de fluorescencia de los canales verde y rojo (ver Fig. 2a), lo que muestra que la fase de agua fluorescente se encapsula de manera eficiente en la pseudovesícula. En segundo lugar, agregamos lípidos fluorescentes verdes (NBD-PC, 1% en peso) a la mezcla de lípidos presente en la fase oleosa marcada con Nile Red. En la Fig. 2b se muestra una imagen compuesta obtenida por microscopía confocal. En la Fig. 2c, trazamos para cada canal los perfiles de intensidad radial normalizados (\((I(r)-I(0))/(I_{\textrm{cap}}+I(0))\), donde \ (I_{\textrm{cap}}\) es la intensidad en la capa de aceite en un canal dado. Estos perfiles revelan un aumento significativo de la señal fluorescente que surge de los lípidos en el límite entre la fase acuosa interna y el gel de agarosa externo Por el contrario, no hay una señal de fluorescencia detectable que surja de la fase de aceite, lo que indica que no hay una capa medible de aceite en la bicapa, en la resolución espacial del microscopio confocal y en el límite de nuestra sensibilidad de imagen de fluorescencia. confirman que la fase interna está encapsulada eficientemente en una bicapa lipídica desprovista de cantidades significativas de aceite. Esto no descarta la presencia de trazas de aceite a escalas de longitud submicrométrica en la bicapa, como se evidencia en las vesículas formadas por la plantilla de la emulsión 33. Sin embargo, fue se muestra en 34 que tales residuos de aceite en la membrana no perjudicaron significativamente las propiedades mecánicas ni la funcionalidad de la membrana. La tensión de la membrana \(\gamma _b\) se puede estimar a partir de los ángulos de contacto de la capa de aceite con las fases acuosa y de agar (consulte la Información complementaria) y produce \(\gamma _b = 4,15 \pm 0,33\) mN/m ( obtenido a partir de 13 imágenes en N=8 pseudovesículas), que es mucho más grande que los valores generalmente informados en vesículas lipídicas electroformadas35,36, \(\gamma _b \sim 10^{-3}\) mN/m. Por el contrario, nuestro valor de tensión de membrana se compara bien con los obtenidos en Droplet Interface Bilayers (DIBs), que son bicapas lipídicas planas obtenidas al poner en contacto dos gotitas acuosas que se bañan en una mezcla de aceite y lípidos (ver, por ejemplo, 37,38,39). En los DIB, también hay interfaces agua/aceite que rodean la bicapa lipídica. El alto valor de \(\gamma _b\) que medimos en nuestra pseudo-vesícula es así, como en los DIB, presumiblemente debido a la presencia de la capa de aceite que sujeta y estira la bicapa en ambos lados.

Para investigar más a fondo la presencia de una bicapa lipídica y su funcionalidad, insertamos proteínas transmembrana \(\alpha \)-hemolisina (\(\alpha \)HL) en la bicapa lipídica. \(\alpha \)HL es un nanoporo heptamérico40 a través del cual pueden difundirse moléculas de carboxifluoresceína41. En la práctica, encontramos que la disolución directa de los monómeros \(\alpha \)HL en la fase acuosa interna estaba disminuyendo la estabilidad de las pseudovesículas, debido a una modificación de la tensión superficial del aceite/agua inducida por nanoporos (ver información complementaria). Por lo tanto, utilizamos pequeñas vesículas unilamelares (SUV) que contienen nanoporos \(\alpha \)HL, preparados principalmente (consulte la sección "Métodos") y dispersos en la fase interna acuosa fluorescente cargada con carboxifluoresceína. Luego, la pseudovesícula se forma como se describió anteriormente, lo que permite que los SUV contenidos en la fase interna se fusionen con la bicapa, como se mostró anteriormente en 42. Esta fusión permite a su vez la inserción de canales transmembrana funcionales en la bicapa lipídica43,44, \(\alpha \)HL en nuestro caso (Fig. 2d). Bajo un macroscopio de epifluorescencia, tomamos imágenes de la fuga de carboxifluoresceína a través de la pseudovesícula adquiriendo una imagen cada 4 minutos, durante dos horas. Realizamos experimentos de control utilizando, por un lado, SUV desprovistos de nanoporos de \(\alpha \)HL y, por otro lado, pseudovesículas preparadas sin SUV ni \(\alpha \)HL. Usando el análisis de imágenes, medimos la intensidad promedio dentro (resp. afuera) de la pseudo-vesícula \(I_{in}\) (resp. \(I_{out}\)) a partir de la cual determinamos el contraste de intensidad de fluorescencia \(\ Gamma = (I_{in}-I_{out})/(I_{in}+I_{out})\). La variación temporal del contraste normalizado \(\Gamma (t) / \Gamma (t=0)\) se presenta en la Fig. 2e. Claramente, el contraste normalizado disminuye con el tiempo para las pseudovesículas que contienen \(\alpha \)HL mientras que permanece constante para las pseudovesículas sin \(\alpha \)HL. Esto establece que la bicapa lipídica se puede funcionalizar con una proteína transmembrana. Más cuantitativamente, ajustando el contraste normalizado con una caída exponencial (línea continua en la Fig. 2e), obtenemos un tiempo de liberación característico de \(5.9\pm 0.3~.10^4\) s. Se espera que esta escala de tiempo aumente con el volumen de la vesícula45. Teniendo en cuenta nuestro gran tamaño de vesícula, nuestros resultados concuerdan con los valores informados en la literatura34,45,46.

(a) Imagen de microscopía confocal compuesta de una pseudovesícula atrapada en un gel de agarosa. La fase interna contiene carboxifluoresceína (verde), mientras que la fase oleosa contiene Nile Red (rojo). (b) Imagen compuesta obtenida mediante la adición de NBD-PC fluorescente al 1 % en peso en la mezcla de lípidos (verde) y un aceite que contiene Nilo Red (rojo). Color amarillo = canales rojos + verdes. Para mayor claridad, la imagen se ha suavizado con un filtro gaussiano de radio de 2 píxeles. Barras de escala = 200 \(\mu \)m. ( c ) Perfil de intensidad de fluorescencia radial normalizado, promediado sobre N = 8 pseudovesículas etiquetadas como en ( b ). Los triángulos verdes (resp. discos rojos) muestran el canal de lípidos fluorescentes (resp. canal de aceite fluorescente). Las barras de error son SE de datos. \(R=316\pm 24\) \(\mu \)m es el tamaño medio de las pseudovesículas. ( d ) Bosquejo de la inserción de \(\alpha \)HL en la membrana de la pseudovesícula, utilizando \(\alpha \)HL cargada SUV. (e) Evolución temporal del contraste normalizado \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0)\), para \(\alpha \)HL cargadas pseudo-vesículas (discos rojos, N=5) y experimentos de control sin \(\alpha \)HL (cuadrados negros, N=5). Las barras de error son SD de datos. La línea sólida es un ajuste exponencial de los datos \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0) = e^{-t/\tau } \approx 1-t/\tau \), con \(\ tau = 5.9\pm 0.3~.10^4 s\).

Dado que la pseudovesícula queda atrapada dentro de la mayor parte del gel de agarosa, se puede deformar al indentar la superficie del gel (Fig. 3a). Comprimimos la superficie del gel con un pistón cuadrado (superficie S=1 \(\hbox {cm}^2\)) montado en una etapa de traslación z motorizada (amplitud de sangría, \(\Delta \)z = 1 mm , Fig. 3b–e), mientras se mide la fuerza normal F aplicada (sección "Métodos"). Con nuestro macroscopio de fluorescencia, tomamos imágenes de una pseudovesícula que contiene carboxifluoresceína, ya que la pseudovesícula se deforma cíclicamente (Fig. 3b-d). Usando el análisis de imágenes, ajustamos una elipse a la forma de la pseudovesícula (excluyendo la capa de aceite del análisis, Fig. 3c). La variación temporal de los ejes largo a y b corto de la elipse se trazan en la Fig. 3f, a partir de la cual calculamos la excentricidad de la elipse \(e = \sqrt{1-b^2/a^2}\). La variación de la excentricidad, \(\Delta e = e(F\ne 0)-e(F=0)\) se puede utilizar como indicador de la deformación. En la Fig. 3g, representamos la tensión de compresión \(\sigma = F/S\) en función de e. Se observa una relación lineal, \(\sigma = K_e \Delta e\), con un módulo de compresión efectivo de la pseudovesícula \(K_e = 12.1\pm 0.6\) kPa. El valor de \(K_e\) es bien distinto del módulo de compresión del gel \(K_{gel} \approx 85\) kPa (ver el recuadro de la Fig. 3g). Además, realizamos experimentos complementarios (ver Información complementaria) que muestran que la presencia de la tapa de aceite no afectaba la deformación de la pseudovesícula. Por lo tanto, nuestro método ofrece una plataforma fácil de usar para estudiar la mecánica de la bicapa lipídica o los procesos de mecanotransducción.

( a ) Esquema de la configuración de excitación mecánica. ( bd ) Imágenes de fluorescencia de macroscopio de pseudovesículas relajadas ( ( b ) Z = 0) o deformadas ( Z = 0, 5 y 1 mm en ( c, d ), respectivamente). En (c) la línea roja es el ajuste del contorno de la parte inferior de la pseudovesícula con una elipse. Barra de escala = 400 \(\mu \)m. (e) Posición del pistón Z(t). ( f ) Ejes mayor (rojo) y menor (azul) de la elipse ajustada en función del tiempo, para una sangría cíclica de 1000 s de largo. (g) Tensión de compresión \(\sigma \) en función de la excentricidad de la elipse e. Las cruces grises corresponden a todos los puntos de datos de (f), los círculos negros son promedios dentro de contenedores de excentricidad \(\delta e\)= 0.01. Las barras de error son SD de los datos. La línea punteada roja es un ajuste lineal a los datos. Recuadro: fuerza normal en función de la muesca del pistón. La línea es un ajuste lineal \(F=\kappa z\), de donde se puede deducir el módulo de compresión del gel, \(K_{gel}=\kappa H/S\), siendo H la altura del gel.

En general, nuestro enfoque constituye un método muy simple para producir y atrapar pseudovesículas dentro de un gel, que es fácil de configurar y económico. Por un lado, el método solo requiere pequeños volúmenes de fase encapsulada (\(\sim \) 1 \(\mu \)L de muestra), a diferencia de las técnicas microfluídicas habituales21 que suelen requerir cientos de microlitros de soluciones para obtener flujos estables. Por otro lado, se basa en una manipulación suave, evitando así la desnaturalización de las proteínas que puede provocar la aplicación de campos eléctricos18,19 como en las técnicas de electroformación. Lo hace de especial interés para el uso de valiosas y delicadas muestras biológicas. Tenga en cuenta, sin embargo, que el valor estimado de la tensión de la membrana en nuestro sistema es mucho mayor que los valores generalmente informados en vesículas electroformadas, presumiblemente debido a la presencia de la tapa de aceite que fija y estira la bicapa en ambos lados. Este efecto debe tenerse en cuenta para futuras aplicaciones del método. Por último, debido a que las pseudovesículas quedan atrapadas en un gel, se localizan fácilmente y no requieren manipulación posterior a la producción, a diferencia de los métodos de plantilla de emulsión. Las pseudovesículas también se pueden deformar fácilmente al indentar la superficie del gel, lo que permite ajustar con precisión tanto la amplitud como la frecuencia de la tensión. Finalmente, las pseudovesículas se incrustan en un gel viscoelástico que imita mejor las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

A menos que se especifique lo contrario, todos los productos químicos se compraron a Sigma Aldrich, Merk inc.

La fase acuosa interna de la gota doble contiene tampón Tris 10 mM (pH=7,5), sacarosa 400 mM y dextrano 100 mg/ml (\(\hbox {M}_w\)=40,10\(^3\) g/ mol,). Para las pseudovesículas fluorescentes, agregamos 20 \(\mu \)M de carboxifluoresceína a este tampón. La osmolaridad de la fase interna, medida con un osmómetro Löser TYP6 es de unos 600 mOsm.

La fase externa está hecha de un 3% en peso de agarosa de baja temperatura de gelificación, disuelta en un tampón que contiene Tris 10 mM (pH = 7,5) y cloruro de potasio 200 mM. Antes de la adición de agarosa, ajustamos la osmolaridad a 380 mosm. Luego se disuelve la agarosa en el tampón en una placa caliente y la solución resultante se mantiene en forma líquida a 85\(^\circ \)C.

La fase oleosa es una mezcla 50/50 p/p de hexadecano y aceite de silicona AR20 en la que se disuelven lípidos secos. La mezcla de lípidos es la que se describe en 45 para imitar la composición de la membrana bacteriana y maximizar su estabilidad en las geometrías de bicapa de interfaz de gota. Consiste en 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC, 81,1 en peso), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC, 10,8 en peso), 1,2-dioleoil -sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DOPG, 5,4% en peso) y colesterol (2,7% en peso). Tenga en cuenta que una concentración tan alta de DOPC evita la formación de dominios lipídicos tanto en la bicapa47,48 como en la interfaz aceite/agua49. En la práctica, preparamos una solución de 7,4 mg de esta mezcla de lípidos disueltos en cloroformo. A continuación, los lípidos se secan en nitrógeno y se mantienen en una atmósfera inerte en un vial de 2 ml a -20\(^\circ \)C durante varias semanas. Inmediatamente antes de su uso, añadimos 2 ml de la fase oleosa para obtener una concentración total de lípidos de 3,7 mg/ml y colocamos el vial en un baño ultrasónico durante 30 minutos a 30 \(^\circ \)C. Esta mezcla de aceite y lípidos se puede utilizar durante unos días.

Para las imágenes confocales, etiquetamos por separado la fase oleosa y los fosfolípidos. La fase oleosa se marca con Nile Red con el siguiente procedimiento: una pequeña cantidad de Nile Red sólido (típicamente la punta de una espátula) se disuelve en 300 \(\mu \)L de acetona. A continuación, se vierten 5 ml de aceite de silicona sobre la acetona y se agita durante la noche a temperatura ambiente para transferir el tinte Nile Red a la fase oleosa mientras se evaporan todos los rastros de disolvente.

Para el marcaje de la bicapa lipídica, se incorporaron lípidos fluorescentes en la mezcla de lípidos siguiendo el procedimiento mencionado anteriormente. Usamos 1-miristoil-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]dodecanoil]-sn-glicero-3-fosfocolina o lípidos NBD-PC que se excitan en 480 nm, lo que nos permite visualizar simultáneamente la fase oleosa marcada con Nile Red y la bicapa lipídica marcada con NBD-PC. En ese caso, las concentraciones finales de lípidos en la mezcla producen: 80,3 % en peso de DOPC, 10,7 % en peso de DPhPC, 2,7 % en peso de colesterol, 5,4 % en peso de DOPG, 1 % en peso de NBD-PC.

La mezcla de lípidos mencionada anteriormente (masa de lípidos total 1,25 mg) se seca bajo nitrógeno en un tubo de ensayo y se deja secar más en una cámara de vacío durante la noche. Al día siguiente, se agrega 1 ml de la fase acuosa interna a la película lipídica y la solución se coloca en un sonicador de sonda durante 30 minutos usando ciclos de encendido/apagado de 15/5 segundos, respectivamente.

Los monómeros \(\alpha \)HL se preparan en el tampón acuoso interno a una concentración de 250 \(\mu \)g/ml. Para obtener SUV decorado con nanoporos \(\alpha \)HL, se añadieron 30 \(\mu \)L de esta solución \(\alpha \)HL a 120 \(\mu \)L de la solución SUV, produciendo una concentración de monómero de poro final de 50 \(\mu \)g/mL. La mezcla resultante se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora y se utiliza como fase interna de las pseudovesículas.

El sándwich fase oleosa/acuosa se realiza siguiendo los pasos descritos en el texto principal. La solución de agarosa tibia se vierte en una cubeta de espectrofotómetro (dimensiones 10x10x40 \(\hbox {mm}^{3}\)). La temperatura de la agarosa se mide con un termopar de temperatura (USB-TC01, National Instrument). Cuando la temperatura alcanza los 38 °C, se forma la gota doble. Se deja enfriar el sistema a temperatura ambiente durante unos 15 minutos, para que la agarosa gelifique alrededor de la pseudovesícula. Tenga en cuenta que, en principio, el método se puede usar en entornos líquidos (sin agarosa), lo que permitiría usar técnicas de eliminación de la capa de aceite como se describe en 22,23,24. Sin embargo, en nuestras primeras pruebas, las altas velocidades de sedimentación de las gotas producidas (que eran grandes y significativamente más densas que la fase exterior) estaban desestabilizando las pseudovesículas durante su formación. Reducir el tamaño de la pseudovesícula (utilizando un diámetro de punta de inyección más pequeño), ajustar la densidad de la fase interna o aumentar la viscosidad de la fase externa reducirá la velocidad de sedimentación de la gota doble producida y parece una ruta prometedora para obtener pseudovesículas estables. en ambientes líquidos.

Para los experimentos de excitación mecánica en agarosa, se añade una fina lámina rectangular de plexiglás (de 1 mm de ancho) en un lado de la cubeta para cubrir su pared, antes de verter la agarosa líquida. A medida que la agarosa se va gelificando, esta lámina se retira con cuidado, dejando un espacio vacío entre el gel de agarosa y la pared de la cubeta. De hecho, debido al efecto de Poisson, se produce una expansión lateral del gel a medida que se comprime verticalmente. Este espacio vacío es necesario para permitir esta expansión lateral y una deformación elástica adecuada del gel.

La cubeta se coloca y fija en el dispositivo que se muestra en la Fig. 3a. El pistón se imprimió en 3D para que se ajuste al tamaño de la cubeta y se pegó una fina lámina de plexiglás a la cara del pistón para indentar la superficie de agarosa. El pistón está montado en una etapa de traslación controlada por un actuador lineal Newport LTA-HL (resolución Z de 1 \(\mu \)m). A medida que el pistón marca el gel, desvía el conjunto de dos voladizos planos unidos a la base del portamuestras. Un sensor capacitivo mide la desviación de los voladizos. Conociendo la rigidez de estos voladizos (de la calibración anterior) deducimos la fuerza normal aplicada F (el ruido de medición en F es 1 mN).

El primer paso de los experimentos de sangría consiste en determinar la posición de la superficie del gel. Para ello, se baja la posición Z del pistón en pasos de 0,1 mm, mientras se mide la fuerza normal. Cuando la fuerza alcanza los 5 mN, la rampa se detiene y esta posición Z se toma como el origen de las coordenadas Z.

Posteriormente, imponemos una deformación cíclica de los geles, indentando el gel, desde esta posición superficial, por un valor \(\Delta Z\), por pasos de 100 \(\mu \)m. En cada paso, se mide la fuerza. Se obtienen imágenes de la pseudovesícula en cada paso de sangría (utilizando un pulso de luz azul, duración 500 ms) con un macroscopio Leica y una cámara Pointgrey (BFLY-U3-23S6C-C).

Para alcanzar tamaños de pseudovesículas más pequeños, usamos una punta de inyección más pequeña. En la práctica utilizamos un tubo de Poliuretano (Phymep) con un diámetro exterior de 240 \(\mu \)m y un diámetro interior de 130 \(\mu \)m. El tubo está conectado a una jeringa de 50 \(\mu \)L (Hamilton), montada en un microinyector casero. Las pseudovesículas se producen en gel de agarosa con el tampón interno fluorescente y se obtienen imágenes mediante epifluorescencia. Determinamos sus tamaños usando análisis de imágenes y encontramos un diámetro promedio \(D= 410 \pm 45 \mu \)m (N=6). En principio, se podrían obtener tamaños más pequeños utilizando una punta de inyección más pequeña. La única dificultad experimental consistirá en formar el sándwich agua/aceite. Será necesario el uso de un microinyector comercial.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. La correspondencia y las solicitudes de datos y materiales en bruto deben dirigirse a EW o L.-LP

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Los autores agradecen a Mathieu Letrou y Sophie Cribier por su valiosa ayuda con la preparación del SUV. EW reconoce el apoyo financiero de Emergence Sorbonne University, LLP reconoce el apoyo de Agence Nationale de la Recherche (BOAT, ANR-17-CE30-0001) y de Emergence(s) Ville de Paris.

Universidad de la Sorbona, CNRS, Instituto de Biología Paris-Seine (IBPS), Laboratorio Jean Perrin (LJP), 4 place Jussieu, 75005, París, Francia

Pierre Tapie, Alexis M. Prevost, Lorraine Montel, Léa-Laetitia Pontani y Elie Wandersman

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EW y LLP concibieron el proyecto y los experimentos, analizaron los resultados y escribieron el documento, PT recopiló los datos experimentales, analizó los resultados y revisó el manuscrito. LM participó en la recopilación de datos experimentales, analizó los resultados y revisó el manuscrito. AP participó en el desarrollo de la configuración experimental, analizó los resultados y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Léa-Laetitia Pontani o Elie Wandersman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Tapie, P., Prevost, AM, Montel, L. et al. Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel. Informe científico 13, 5375 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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Recibido: 13 julio 2022

Aceptado: 21 de marzo de 2023

Publicado: 02 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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