Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel

Blog

HogarHogar / Blog / Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel

Mar 18, 2023

Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5375 (2023) Citar este artículo

1406 Accesos

5 Altmetric

Detalles de métricas

Presentamos un método simple para producir pseudovesículas lipídicas gigantes (vesículas con una tapa aceitosa en la parte superior), atrapadas en un gel de agarosa. El método se puede implementar usando solo una micropipeta normal y se basa en la formación de una gota doble de agua/aceite/agua en agarosa líquida. Caracterizamos la vesícula producida con imágenes de fluorescencia y establecemos la presencia e integridad de la bicapa lipídica mediante la inserción exitosa de proteínas transmembrana \(\alpha \)-hemolisina. Finalmente, mostramos que la vesícula se puede deformar fácilmente mecánicamente, de forma no intrusiva, al indentar la superficie del gel.

Las vesículas se han utilizado ampliamente para imitar la compartimentación celular y reproducir funciones biológicas específicas in vitro con enfoques ascendentes1,2. En muchos estudios recientes, la atención se centró en la encapsulación de reacciones biológicas complejas dentro de las vesículas, para expresar proteínas3 o genes4, o para reconstituir y estudiar los filamentos de proteínas del citoesqueleto, como la corteza de actina5 o los microtúbulos aster6. Muchos otros trabajos pretenden imitar las propiedades de la membrana celular, como por ejemplo la fusión de membranas7,8,9, o la comunicación celular, mediante la inserción de proteínas transmembrana en liposomas. En particular, se han insertado canales mecanosensibles10,11 en la membrana de los liposomas, lo que a su vez permite medir su conductancia bajo estrés mecánico.

La producción de vesículas generalmente se basa en métodos de hidratación o plantillas de emulsión invertida. Los métodos de hidratación se basan en el hinchamiento de películas lipídicas secas en un tampón acuoso12,13. Son relativamente simples de operar pero producen tamaños de vesícula polidispersos y una eficiencia de encapsulación relativamente no homogénea14,15,16. La tasa de producción de vesículas unilamelares se puede mejorar mediante el uso de campos eléctricos (métodos de electroformación17), pero los campos aplicados pueden dañar las frágiles proteínas18,19 y la técnica también se limita a tampones con bajas concentraciones iónicas. Las plantillas de emulsión invertida, por otro lado, se basan en el paso forzado de gotas de una emulsión de agua en aceite a través de una interfaz de agua/aceite5,20. Este método se puede desarrollar en chips microfluídicos21,22,23,24, lo que produce tamaños de vesículas monodispersos, que están limitados por las dimensiones del canal microfluídico.

En ambos métodos (hidratación o emulsiones), las vesículas resultantes se dispersan en el medio exterior, lo que requiere pasos adicionales para manipularlas o transferirlas en diferentes ambientes (micropipetas25, trampeo óptico26, etc). Estos pasos adicionales, que se basan en habilidades técnicas específicas, dificultan la replicación de muchos experimentos y la recopilación de grandes estadísticas sobre las propiedades de los sistemas. En particular, para estudiar los procesos de mecanotransducción, se requiere estimular mecánicamente las vesículas. En la práctica, esto se ha logrado típicamente con deformaciones locales de la membrana (succión de pipeta27, flujos de fluidos28,29, AFM30,31). Sin embargo, estos métodos no reproducen fielmente la naturaleza de las perturbaciones mecánicas en los tejidos. Además, pasan por alto el acoplamiento mecánico entre las células y su entorno biológico viscoelástico.

Proponemos aquí una nueva técnica, que proporciona una plataforma versátil para la producción sencilla de pseudo-vesículas biomiméticas (una vesícula con una tapa aceitosa en la parte superior), pero también permite su captura y excitación mecánica no intrusiva.

(a–f) (fila superior) Esquema del método de producción de doble emulsión. Los colores verde/naranja/azul representan las fases interna/aceite/externa, respectivamente. (fila inferior) Imágenes de campo claro. Barras de escala = 500 \(\mu \)m. La gota de emulsión doble producida en (f) sedimenta en la agarosa líquida y finalmente queda atrapada cuando la agarosa gelifica. Simultáneamente, la capa de aceite que la rodea forma crema en la parte superior de la gota y una bicapa lipídica se cierra en la parte inferior. Unos minutos más tarde, la pseudovesícula se ha formado y queda atrapada en el gel, como se muestra en (g). Panel inferior: imagen macroscópica de fluorescencia de una pseudovesícula cargada con carboxifluoresceína atrapada en un gel de agarosa. Barra de escala = 200 \(\mu \)m.

Las vesículas se producen a partir de agua en una configuración de gotitas de aceite que contienen lípidos, que se forma en una solución de agarosa líquida y tibia (los detalles sobre los productos químicos se pueden encontrar en la sección "Métodos"). Primero extraemos un pequeño volumen (alrededor de 500 nL) de la fase acuosa interna (Fig. 1a), usando una micropipeta de 2.5 \(\mu \)L (Eppendorf). En segundo lugar, metemos la pipeta en el recipiente de aceite/lípidos y aspiramos unos 50 nL (Fig. 1b), girando la rueda de ajuste de la micropipeta mientras la punta está sumergida en el aceite. La punta de la pipeta contiene así un sándwich de aceite/agua. Por último, movemos la pipeta a la solución de agarosa tibia (temperatura \(T\approx 38\,^{\circ }C\), ver detalles en la sección "Métodos") donde expulsamos el sándwich de aceite/agua girándolo hacia atrás. la rueda de ajuste de la micropipeta. Durante esta fase de expulsión, la fase oleosa primero se convierte en una gota en la agarosa líquida (Fig. 1c), seguida por la fase acuosa que crece en su interior (Fig. 1d, e). Finalmente, movemos rápidamente la pipeta hacia arriba en el aire, lo que separa la doble gota de la punta debido a la fricción viscosa de la solución de agarosa (Fig. 1f).

Inmediatamente después de su formación, la gota de agua interior está rodeada por una capa de aceite que contiene fosfolípidos. Por lo tanto, estos lípidos se redistribuyen en ambas interfaces agua-aceite, con sus cabezas hidrofílicas giradas hacia la fase acuosa interna por un lado y hacia la solución de agarosa por el otro lado. Mientras la solución de agarosa se enfría, la gota doble se sedimenta lentamente en la solución de agarosa y finalmente queda atrapada en el gel formado. Durante este proceso de enfriamiento, la capa de aceite de la gotita doble crece bajo la acción de la gravedad para formar una capa de aceite, mientras que los lípidos que estabilizan las antiguas interfaces aceite/agua forman una bicapa lipídica en la parte inferior de la gotita (Fig. 1g). La gota doble se convierte en una pseudovesícula. Este sencillo método de micropipeta produce pseudovesículas con un diámetro de 601 \(\pm 58 \mu \)m (N = 98). Se pueden obtener tamaños más pequeños utilizando puntas más pequeñas y un microinyector (consulte la sección "Métodos"). La tasa de producción del método es de alrededor de 5 pseudovesículas por minuto y la tasa de éxito es en general de alrededor del 30%. Una vez atrapada en el gel, la pseudovesícula es estable durante varias horas y puede conservarse durante la noche si la cubeta que contiene el gel está sellada para evitar la evaporación. Además, al estar atrapadas en el gel, las pseudovesículas se pueden observar fácilmente con un microscopio, como en32.

Para caracterizar la pseudovesícula y probar la existencia de una bicapa lipídica, primero usamos marcadores fluorescentes dispersos tanto en la fase acuosa interna (carboxifluoresceína, longitud de onda de emisión \(\lambda _c = 525\) nm, verde, ver sección "Métodos" ) y la fase de aceite (rojo Nilo, longitud de onda de emisión \(\lambda _n = 636\) nm, rojo). La pseudovesícula se produce en el gel de agarosa como se describió anteriormente y se obtienen más imágenes usando un microscopio confocal, con un objetivo de 4x. Se registran las imágenes de fluorescencia de los canales verde y rojo (ver Fig. 2a), lo que muestra que la fase de agua fluorescente se encapsula de manera eficiente en la pseudovesícula. En segundo lugar, agregamos lípidos fluorescentes verdes (NBD-PC, 1% en peso) a la mezcla de lípidos presente en la fase oleosa marcada con Nile Red. En la Fig. 2b se muestra una imagen compuesta obtenida por microscopía confocal. En la Fig. 2c, trazamos para cada canal los perfiles de intensidad radial normalizados (\((I(r)-I(0))/(I_{\textrm{cap}}+I(0))\), donde \ (I_{\textrm{cap}}\) es la intensidad en la capa de aceite en un canal dado. Estos perfiles revelan un aumento significativo de la señal fluorescente que surge de los lípidos en el límite entre la fase acuosa interna y el gel de agarosa externo Por el contrario, no hay una señal de fluorescencia detectable que surja de la fase de aceite, lo que indica que no hay una capa medible de aceite en la bicapa, en la resolución espacial del microscopio confocal y en el límite de nuestra sensibilidad de imagen de fluorescencia. confirman que la fase interna está encapsulada eficientemente en una bicapa lipídica desprovista de cantidades significativas de aceite. Esto no descarta la presencia de trazas de aceite a escalas de longitud submicrométrica en la bicapa, como se evidencia en las vesículas formadas por la plantilla de la emulsión 33. Sin embargo, fue se muestra en 34 que tales residuos de aceite en la membrana no perjudicaron significativamente las propiedades mecánicas ni la funcionalidad de la membrana. La tensión de la membrana \(\gamma _b\) se puede estimar a partir de los ángulos de contacto de la capa de aceite con las fases acuosa y de agar (consulte la Información complementaria) y produce \(\gamma _b = 4,15 \pm 0,33\) mN/m ( obtenido a partir de 13 imágenes en N=8 pseudovesículas), que es mucho más grande que los valores generalmente informados en vesículas lipídicas electroformadas35,36, \(\gamma _b \sim 10^{-3}\) mN/m. Por el contrario, nuestro valor de tensión de membrana se compara bien con los obtenidos en Droplet Interface Bilayers (DIBs), que son bicapas lipídicas planas obtenidas al poner en contacto dos gotitas acuosas que se bañan en una mezcla de aceite y lípidos (ver, por ejemplo, 37,38,39). En los DIB, también hay interfaces agua/aceite que rodean la bicapa lipídica. El alto valor de \(\gamma _b\) que medimos en nuestra pseudo-vesícula es así, como en los DIB, presumiblemente debido a la presencia de la capa de aceite que sujeta y estira la bicapa en ambos lados.

Para investigar más a fondo la presencia de una bicapa lipídica y su funcionalidad, insertamos proteínas transmembrana \(\alpha \)-hemolisina (\(\alpha \)HL) en la bicapa lipídica. \(\alpha \)HL es un nanoporo heptamérico40 a través del cual pueden difundirse moléculas de carboxifluoresceína41. En la práctica, encontramos que la disolución directa de los monómeros \(\alpha \)HL en la fase acuosa interna estaba disminuyendo la estabilidad de las pseudovesículas, debido a una modificación de la tensión superficial del aceite/agua inducida por nanoporos (ver información complementaria). Por lo tanto, utilizamos pequeñas vesículas unilamelares (SUV) que contienen nanoporos \(\alpha \)HL, preparados principalmente (consulte la sección "Métodos") y dispersos en la fase interna acuosa fluorescente cargada con carboxifluoresceína. Luego, la pseudovesícula se forma como se describió anteriormente, lo que permite que los SUV contenidos en la fase interna se fusionen con la bicapa, como se mostró anteriormente en 42. Esta fusión permite a su vez la inserción de canales transmembrana funcionales en la bicapa lipídica43,44, \(\alpha \)HL en nuestro caso (Fig. 2d). Bajo un macroscopio de epifluorescencia, tomamos imágenes de la fuga de carboxifluoresceína a través de la pseudovesícula adquiriendo una imagen cada 4 minutos, durante dos horas. Realizamos experimentos de control utilizando, por un lado, SUV desprovistos de nanoporos de \(\alpha \)HL y, por otro lado, pseudovesículas preparadas sin SUV ni \(\alpha \)HL. Usando el análisis de imágenes, medimos la intensidad promedio dentro (resp. afuera) de la pseudo-vesícula \(I_{in}\) (resp. \(I_{out}\)) a partir de la cual determinamos el contraste de intensidad de fluorescencia \(\ Gamma = (I_{in}-I_{out})/(I_{in}+I_{out})\). La variación temporal del contraste normalizado \(\Gamma (t) / \Gamma (t=0)\) se presenta en la Fig. 2e. Claramente, el contraste normalizado disminuye con el tiempo para las pseudovesículas que contienen \(\alpha \)HL mientras que permanece constante para las pseudovesículas sin \(\alpha \)HL. Esto establece que la bicapa lipídica se puede funcionalizar con una proteína transmembrana. Más cuantitativamente, ajustando el contraste normalizado con una caída exponencial (línea continua en la Fig. 2e), obtenemos un tiempo de liberación característico de \(5.9\pm 0.3~.10^4\) s. Se espera que esta escala de tiempo aumente con el volumen de la vesícula45. Teniendo en cuenta nuestro gran tamaño de vesícula, nuestros resultados concuerdan con los valores informados en la literatura34,45,46.

(a) Imagen de microscopía confocal compuesta de una pseudovesícula atrapada en un gel de agarosa. La fase interna contiene carboxifluoresceína (verde), mientras que la fase oleosa contiene Nile Red (rojo). (b) Imagen compuesta obtenida mediante la adición de NBD-PC fluorescente al 1 % en peso en la mezcla de lípidos (verde) y un aceite que contiene Nilo Red (rojo). Color amarillo = canales rojos + verdes. Para mayor claridad, la imagen se ha suavizado con un filtro gaussiano de radio de 2 píxeles. Barras de escala = 200 \(\mu \)m. ( c ) Perfil de intensidad de fluorescencia radial normalizado, promediado sobre N = 8 pseudovesículas etiquetadas como en ( b ). Los triángulos verdes (resp. discos rojos) muestran el canal de lípidos fluorescentes (resp. canal de aceite fluorescente). Las barras de error son SE de datos. \(R=316\pm 24\) \(\mu \)m es el tamaño medio de las pseudovesículas. ( d ) Bosquejo de la inserción de \(\alpha \)HL en la membrana de la pseudovesícula, utilizando \(\alpha \)HL cargada SUV. (e) Evolución temporal del contraste normalizado \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0)\), para \(\alpha \)HL cargadas pseudo-vesículas (discos rojos, N=5) y experimentos de control sin \(\alpha \)HL (cuadrados negros, N=5). Las barras de error son SD de datos. La línea sólida es un ajuste exponencial de los datos \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0) = e^{-t/\tau } \approx 1-t/\tau \), con \(\ tau = 5.9\pm 0.3~.10^4 s\).

Dado que la pseudovesícula queda atrapada dentro de la mayor parte del gel de agarosa, se puede deformar al indentar la superficie del gel (Fig. 3a). Comprimimos la superficie del gel con un pistón cuadrado (superficie S=1 \(\hbox {cm}^2\)) montado en una etapa de traslación z motorizada (amplitud de sangría, \(\Delta \)z = 1 mm , Fig. 3b–e), mientras se mide la fuerza normal F aplicada (sección "Métodos"). Con nuestro macroscopio de fluorescencia, tomamos imágenes de una pseudovesícula que contiene carboxifluoresceína, ya que la pseudovesícula se deforma cíclicamente (Fig. 3b-d). Usando el análisis de imágenes, ajustamos una elipse a la forma de la pseudovesícula (excluyendo la capa de aceite del análisis, Fig. 3c). La variación temporal de los ejes largo a y b corto de la elipse se trazan en la Fig. 3f, a partir de la cual calculamos la excentricidad de la elipse \(e = \sqrt{1-b^2/a^2}\). La variación de la excentricidad, \(\Delta e = e(F\ne 0)-e(F=0)\) se puede utilizar como indicador de la deformación. En la Fig. 3g, representamos la tensión de compresión \(\sigma = F/S\) en función de e. Se observa una relación lineal, \(\sigma = K_e \Delta e\), con un módulo de compresión efectivo de la pseudovesícula \(K_e = 12.1\pm 0.6\) kPa. El valor de \(K_e\) es bien distinto del módulo de compresión del gel \(K_{gel} \approx 85\) kPa (ver el recuadro de la Fig. 3g). Además, realizamos experimentos complementarios (ver Información complementaria) que muestran que la presencia de la tapa de aceite no afectaba la deformación de la pseudovesícula. Por lo tanto, nuestro método ofrece una plataforma fácil de usar para estudiar la mecánica de la bicapa lipídica o los procesos de mecanotransducción.

( a ) Esquema de la configuración de excitación mecánica. ( bd ) Imágenes de fluorescencia de macroscopio de pseudovesículas relajadas ( ( b ) Z = 0) o deformadas ( Z = 0, 5 y 1 mm en ( c, d ), respectivamente). En (c) la línea roja es el ajuste del contorno de la parte inferior de la pseudovesícula con una elipse. Barra de escala = 400 \(\mu \)m. (e) Posición del pistón Z(t). ( f ) Ejes mayor (rojo) y menor (azul) de la elipse ajustada en función del tiempo, para una sangría cíclica de 1000 s de largo. (g) Tensión de compresión \(\sigma \) en función de la excentricidad de la elipse e. Las cruces grises corresponden a todos los puntos de datos de (f), los círculos negros son promedios dentro de contenedores de excentricidad \(\delta e\)= 0.01. Las barras de error son SD de los datos. La línea punteada roja es un ajuste lineal a los datos. Recuadro: fuerza normal en función de la muesca del pistón. La línea es un ajuste lineal \(F=\kappa z\), de donde se puede deducir el módulo de compresión del gel, \(K_{gel}=\kappa H/S\), siendo H la altura del gel.

En general, nuestro enfoque constituye un método muy simple para producir y atrapar pseudovesículas dentro de un gel, que es fácil de configurar y económico. Por un lado, el método solo requiere pequeños volúmenes de fase encapsulada (\(\sim \) 1 \(\mu \)L de muestra), a diferencia de las técnicas microfluídicas habituales21 que suelen requerir cientos de microlitros de soluciones para obtener flujos estables. Por otro lado, se basa en una manipulación suave, evitando así la desnaturalización de las proteínas que puede provocar la aplicación de campos eléctricos18,19 como en las técnicas de electroformación. Lo hace de especial interés para el uso de valiosas y delicadas muestras biológicas. Tenga en cuenta, sin embargo, que el valor estimado de la tensión de la membrana en nuestro sistema es mucho mayor que los valores generalmente informados en vesículas electroformadas, presumiblemente debido a la presencia de la tapa de aceite que fija y estira la bicapa en ambos lados. Este efecto debe tenerse en cuenta para futuras aplicaciones del método. Por último, debido a que las pseudovesículas quedan atrapadas en un gel, se localizan fácilmente y no requieren manipulación posterior a la producción, a diferencia de los métodos de plantilla de emulsión. Las pseudovesículas también se pueden deformar fácilmente al indentar la superficie del gel, lo que permite ajustar con precisión tanto la amplitud como la frecuencia de la tensión. Finalmente, las pseudovesículas se incrustan en un gel viscoelástico que imita mejor las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

A menos que se especifique lo contrario, todos los productos químicos se compraron a Sigma Aldrich, Merk inc.

La fase acuosa interna de la gota doble contiene tampón Tris 10 mM (pH=7,5), sacarosa 400 mM y dextrano 100 mg/ml (\(\hbox {M}_w\)=40,10\(^3\) g/ mol,). Para las pseudovesículas fluorescentes, agregamos 20 \(\mu \)M de carboxifluoresceína a este tampón. La osmolaridad de la fase interna, medida con un osmómetro Löser TYP6 es de unos 600 mOsm.

La fase externa está hecha de un 3% en peso de agarosa de baja temperatura de gelificación, disuelta en un tampón que contiene Tris 10 mM (pH = 7,5) y cloruro de potasio 200 mM. Antes de la adición de agarosa, ajustamos la osmolaridad a 380 mosm. Luego se disuelve la agarosa en el tampón en una placa caliente y la solución resultante se mantiene en forma líquida a 85\(^\circ \)C.

La fase oleosa es una mezcla 50/50 p/p de hexadecano y aceite de silicona AR20 en la que se disuelven lípidos secos. La mezcla de lípidos es la que se describe en 45 para imitar la composición de la membrana bacteriana y maximizar su estabilidad en las geometrías de bicapa de interfaz de gota. Consiste en 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC, 81,1 en peso), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC, 10,8 en peso), 1,2-dioleoil -sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DOPG, 5,4% en peso) y colesterol (2,7% en peso). Tenga en cuenta que una concentración tan alta de DOPC evita la formación de dominios lipídicos tanto en la bicapa47,48 como en la interfaz aceite/agua49. En la práctica, preparamos una solución de 7,4 mg de esta mezcla de lípidos disueltos en cloroformo. A continuación, los lípidos se secan en nitrógeno y se mantienen en una atmósfera inerte en un vial de 2 ml a -20\(^\circ \)C durante varias semanas. Inmediatamente antes de su uso, añadimos 2 ml de la fase oleosa para obtener una concentración total de lípidos de 3,7 mg/ml y colocamos el vial en un baño ultrasónico durante 30 minutos a 30 \(^\circ \)C. Esta mezcla de aceite y lípidos se puede utilizar durante unos días.

Para las imágenes confocales, etiquetamos por separado la fase oleosa y los fosfolípidos. La fase oleosa se marca con Nile Red con el siguiente procedimiento: una pequeña cantidad de Nile Red sólido (típicamente la punta de una espátula) se disuelve en 300 \(\mu \)L de acetona. A continuación, se vierten 5 ml de aceite de silicona sobre la acetona y se agita durante la noche a temperatura ambiente para transferir el tinte Nile Red a la fase oleosa mientras se evaporan todos los rastros de disolvente.

Para el marcaje de la bicapa lipídica, se incorporaron lípidos fluorescentes en la mezcla de lípidos siguiendo el procedimiento mencionado anteriormente. Usamos 1-miristoil-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]dodecanoil]-sn-glicero-3-fosfocolina o lípidos NBD-PC que se excitan en 480 nm, lo que nos permite visualizar simultáneamente la fase oleosa marcada con Nile Red y la bicapa lipídica marcada con NBD-PC. En ese caso, las concentraciones finales de lípidos en la mezcla producen: 80,3 % en peso de DOPC, 10,7 % en peso de DPhPC, 2,7 % en peso de colesterol, 5,4 % en peso de DOPG, 1 % en peso de NBD-PC.

La mezcla de lípidos mencionada anteriormente (masa de lípidos total 1,25 mg) se seca bajo nitrógeno en un tubo de ensayo y se deja secar más en una cámara de vacío durante la noche. Al día siguiente, se agrega 1 ml de la fase acuosa interna a la película lipídica y la solución se coloca en un sonicador de sonda durante 30 minutos usando ciclos de encendido/apagado de 15/5 segundos, respectivamente.

Los monómeros \(\alpha \)HL se preparan en el tampón acuoso interno a una concentración de 250 \(\mu \)g/ml. Para obtener SUV decorado con nanoporos \(\alpha \)HL, se añadieron 30 \(\mu \)L de esta solución \(\alpha \)HL a 120 \(\mu \)L de la solución SUV, produciendo una concentración de monómero de poro final de 50 \(\mu \)g/mL. La mezcla resultante se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora y se utiliza como fase interna de las pseudovesículas.

El sándwich fase oleosa/acuosa se realiza siguiendo los pasos descritos en el texto principal. La solución de agarosa tibia se vierte en una cubeta de espectrofotómetro (dimensiones 10x10x40 \(\hbox {mm}^{3}\)). La temperatura de la agarosa se mide con un termopar de temperatura (USB-TC01, National Instrument). Cuando la temperatura alcanza los 38 °C, se forma la gota doble. Se deja enfriar el sistema a temperatura ambiente durante unos 15 minutos, para que la agarosa gelifique alrededor de la pseudovesícula. Tenga en cuenta que, en principio, el método se puede usar en entornos líquidos (sin agarosa), lo que permitiría usar técnicas de eliminación de la capa de aceite como se describe en 22,23,24. Sin embargo, en nuestras primeras pruebas, las altas velocidades de sedimentación de las gotas producidas (que eran grandes y significativamente más densas que la fase exterior) estaban desestabilizando las pseudovesículas durante su formación. Reducir el tamaño de la pseudovesícula (utilizando un diámetro de punta de inyección más pequeño), ajustar la densidad de la fase interna o aumentar la viscosidad de la fase externa reducirá la velocidad de sedimentación de la gota doble producida y parece una ruta prometedora para obtener pseudovesículas estables. en ambientes líquidos.

Para los experimentos de excitación mecánica en agarosa, se añade una fina lámina rectangular de plexiglás (de 1 mm de ancho) en un lado de la cubeta para cubrir su pared, antes de verter la agarosa líquida. A medida que la agarosa se va gelificando, esta lámina se retira con cuidado, dejando un espacio vacío entre el gel de agarosa y la pared de la cubeta. De hecho, debido al efecto de Poisson, se produce una expansión lateral del gel a medida que se comprime verticalmente. Este espacio vacío es necesario para permitir esta expansión lateral y una deformación elástica adecuada del gel.

La cubeta se coloca y fija en el dispositivo que se muestra en la Fig. 3a. El pistón se imprimió en 3D para que se ajuste al tamaño de la cubeta y se pegó una fina lámina de plexiglás a la cara del pistón para indentar la superficie de agarosa. El pistón está montado en una etapa de traslación controlada por un actuador lineal Newport LTA-HL (resolución Z de 1 \(\mu \)m). A medida que el pistón marca el gel, desvía el conjunto de dos voladizos planos unidos a la base del portamuestras. Un sensor capacitivo mide la desviación de los voladizos. Conociendo la rigidez de estos voladizos (de la calibración anterior) deducimos la fuerza normal aplicada F (el ruido de medición en F es 1 mN).

El primer paso de los experimentos de sangría consiste en determinar la posición de la superficie del gel. Para ello, se baja la posición Z del pistón en pasos de 0,1 mm, mientras se mide la fuerza normal. Cuando la fuerza alcanza los 5 mN, la rampa se detiene y esta posición Z se toma como el origen de las coordenadas Z.

Posteriormente, imponemos una deformación cíclica de los geles, indentando el gel, desde esta posición superficial, por un valor \(\Delta Z\), por pasos de 100 \(\mu \)m. En cada paso, se mide la fuerza. Se obtienen imágenes de la pseudovesícula en cada paso de sangría (utilizando un pulso de luz azul, duración 500 ms) con un macroscopio Leica y una cámara Pointgrey (BFLY-U3-23S6C-C).

Para alcanzar tamaños de pseudovesículas más pequeños, usamos una punta de inyección más pequeña. En la práctica utilizamos un tubo de Poliuretano (Phymep) con un diámetro exterior de 240 \(\mu \)m y un diámetro interior de 130 \(\mu \)m. El tubo está conectado a una jeringa de 50 \(\mu \)L (Hamilton), montada en un microinyector casero. Las pseudovesículas se producen en gel de agarosa con el tampón interno fluorescente y se obtienen imágenes mediante epifluorescencia. Determinamos sus tamaños usando análisis de imágenes y encontramos un diámetro promedio \(D= 410 \pm 45 \mu \)m (N=6). En principio, se podrían obtener tamaños más pequeños utilizando una punta de inyección más pequeña. La única dificultad experimental consistirá en formar el sándwich agua/aceite. Será necesario el uso de un microinyector comercial.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. La correspondencia y las solicitudes de datos y materiales en bruto deben dirigirse a EW o L.-LP

Wang, X. et al. Conjuntos de fosfolípidos versátiles para células sintéticas funcionales y tejidos artificiales. Adv. Mate. 33, 1 (2021).

CAS Google Académico

Jeong, S., Nguyen, HT, Kim, CH, Ly, MN y Shin, K. Hacia células artificiales: avances novedosos en conversión de energía y motilidad celular. Adv. Función Mate. 30, 1907182 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Noireaux, V. & Libchaber, A. Un biorreactor de vesículas como paso hacia un ensamblaje celular artificial. proc. nacional Academia ciencia 101, 17669 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niederholtmeyer, H., Chaggan, C. & Devaraj, NK Comunicación y detección de quórum en imitadores no vivos de células eucariotas. Nat. común 9, 1 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Pontani, L.-L. et al. Reconstitución de una corteza de actina dentro de un liposoma. Biografía. j 96, 192 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gavriljuk, K. et al. Un liposoma morfogénico sintético autoorganizado responde con cambios de forma a señales de luz locales. Nat. común 12(1), 1548 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, Y.-HM, van Lengerich, B. & Boxer, SG El ADN anclado en lípidos media la fusión de vesículas según se observa mediante la mezcla de lípidos y contenido. Biointerfases 3, FA17 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chan, Y.-HM, van Lengerich, B. & Boxer, SG Efectos de las secuencias enlazadoras en la fusión de vesículas mediada por oligonucleótidos de ADN anclados a lípidos. proc. nacional Academia ciencia 106, 979 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heuvingh, J., Pincet, F. y Cribier, S. Hemifusión y fusión de vesículas gigantes inducidas por la reducción de la distancia entre membranas. EUR. física J.E 14, 269 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Garamella, J. et al. Una célula sintética adaptativa basada en mecanodetección, biodetección y circuitos genéticos inducibles. Sintetizador ACS. Biol. 8, 1913 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hindley, JW y col. Construcción de una vía de señalización mecanosensible sintética en células artificiales compartimentadas. PNAS 116, 16711 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bangham, AD & Horne, R. Tinción negativa de fosfolípidos y su modificación estructural por agentes tensioactivos observados en el microscopio electrónico. J. Mol. Biol. 8, 660 (1964).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C. y Sandoghdar, V. Producción de vesículas unilamelares gigantes aisladas bajo altas concentraciones de sal. Frente. Fisiol. 8, 63 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dominak, LM & Keating, CD Encapsulación de polímeros dentro de vesículas lipídicas gigantes. Langmuir 23, 7148 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dominak, LM & Keating, CD El apiñamiento macromolecular mejora la encapsulación de polímeros dentro de vesículas lipídicas gigantes. Langmuir 24, 13565 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Blanken, D., van Nies, P. y Danelon, C. Las imágenes cuantitativas de liposomas que expresan genes revelan fenotipos favorables raros. física Biol. 16, 045002 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Angelova, MI & Dimitrov, DS Electroformación de liposomas. Discusión de Faraday. química Soc. 81, 303 (1986).

Artículo CAS Google Académico

Chen, W. Desnaturalización electroconformacional de proteínas de membrana. Ana. Academia de Nueva York. ciencia 1066, 92 (2006).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Freedman, KJ, Haq, SR, Edel, JB, Jemth, P. & Kim, MJ Despliegue y estiramiento de una sola molécula de dominios de proteína dentro de un nanoporo de estado sólido por campo eléctrico. ciencia Rep. 3, 1 (2013).

Artículo Google Académico

Pautot, S., Frisken, BJ & Weitz, D. Producción de vesículas unilaminares utilizando una emulsión invertida. Langmuir 19, 2870 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Li, W. et al. Fabricación microfluídica de micropartículas para aplicaciones biomédicas. química Soc. Rev. 47, 5646 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deshpande, S. & Dekker, C. Producción microfluídica en chip de liposomas de tamaño celular. Nat. Protocolo 13, 856 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, AE y Dekker, C. Ensamblaje de liposomas asistido por octanol en chip. Nat. común 7, 1 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Krafft, D. et al. Compartimentos para células sintéticas: separación osmóticamente asistida de aceite de emulsiones dobles en un chip microfluídico. ChemBioChem 20, 2604 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, E. & Needham, D. Propiedades físicas de las membranas bicapa de surfactante: transiciones térmicas, elasticidad, rigidez, cohesión e interacciones coloidales. J. física. química 91, 4219 (1987).

Artículo CAS Google Académico

Kulin, S. et al. Manipulación óptica y fusión de liposomas como microrreactores. Langmuir 19, 8206 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Garten, M. et al. Sujeción de parche de GUV completo. PNAS 114, 328 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Robinson, T. Manejo y análisis de microfluidos de vesículas gigantes para su uso como células artificiales: una revisión. Adv. biosist. 3, 1800318 (2019).

Artículo Google Académico

Deschamps, J. et al. Dinámica de una vesícula en flujo general. PNAS 106, 11444 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central MATH Google Scholar

Schäfer, E. et al. Respuesta mecánica de liposomas gigantes adherentes a la indentación con una punta cónica de AFM. Materia blanda 11, 4487 (2015).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Lin, YC et al. Cambios conformacionales inducidos por la fuerza en Piezo1. Naturaleza 573, 230 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lira, RB, Steinkühler, J., Knorr, RL, Dimova, R. y Riske, KA Posando para una fotografía: inmovilización de vesículas en gel de agarosa. ciencia Rep. 6, 1 (2016).

Artículo Google Académico

Campillo, C. et al. Dinámica de membrana inesperada revelada por extrusión de nanotubos de membrana. Biografía. j 104, 1248 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van de Cauter, L. et al. cDICE optimizado para la reconstitución eficiente de sistemas biológicos en vesículas unilaminares gigantes. Sintetizador ACS. Biol. 10, 1690 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hochmuth, F., Shao, J.-Y., Dai, J. & Sheetz, MP Deformación y flujo de membrana en ataduras extraídas de conos de crecimiento neuronal. Biografía. j 70, 358 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rädler, JO, Feder, TJ, Strey, HH y Sackmann, E. Análisis de fluctuación de las fuerzas de ondulación controladas por tensión entre vesículas gigantes y sustratos sólidos. física Rev. E 51, 4526 (1995).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Stephenson, EB, Korner, JL y Elvira, KS Desafíos y oportunidades para lograr todo el potencial de las bicapas de interfaz de gotas. Nat. química 14, 862 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Taylor, GJ, Venkatesan, GA, Collier, CP y Sarles, SA Medición directa in situ de capacitancia específica, tensión monocapa y tensión bicapa en una bicapa de interfaz de gota. Materia blanda 11, 7592 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Huang, Y., Chandran Suja, V., Amirthalingam, L. & Fuller, GG Influencia de la sal en la formación y separación de bicapas de interfaz de gotas. física Fluidos 34, 067107 (2022).

Artículo ADS CAS Google Académico

Gouaux, JE et al. Estequiometría de subunidades de alfa-hemolisina estafilocócica en cristales y membranas: un poro transmembrana heptamérico. PNAS 91, 12828 (1994).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Valet, M. et al. Difusión a través de nanoporos en redes de bicapa lipídica conectadas. PRL 123, 088101 (2019).

Artículo ADS CAS Google Académico

Lira, RB, Robinson, T., Dimova, R. & Riske, KA Fusión de membrana libre de proteínas altamente eficiente: un estudio de vesículas gigantes. Biografía. j 116, 79 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barriga, HM et al. Reconstitución de bicapa de interfase de gota y medición de actividad del canal mecanosensible de gran conductancia de Escherichia coli. JR Soc. Interfaz 11, 20140404 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P. y Toombes, GE Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes para microscopía y estudios de pinzamiento de parche. JoVE (J. Vis. Exp.), e52281 (2015).

Dupin, A. & Simmel, FC Señalización y diferenciación en circuitos génicos in vitro multicompartimentados basados ​​en emulsión. Nat. química 11, 32 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lu, L., Schertzer, JW y Chiarot, PR Fabricación microfluídica continua de vesículas asimétricas sintéticas. Ficha de laboratorio 15, 3591 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Veatch, SL & Keller, SL Separación de fases líquidas en vesículas gigantes de mezclas ternarias de fosfolípidos y colesterol. Biografía. j 85, 3074 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sorre, B. et al. La clasificación de lípidos impulsada por la curvatura necesita proximidad a un punto de desmezcla y cuenta con la ayuda de proteínas. proc. nacional Academia ciencia 106, 5622 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pontani, L.-L., Haase, MF, Raczkowska, I. & Brujic, J. Los lípidos inmiscibles controlan la morfología de las emulsiones irregulares. Materia blanda 9, 7150 (2013).

Artículo ADS CAS Google Académico

Descargar referencias

Los autores agradecen a Mathieu Letrou y Sophie Cribier por su valiosa ayuda con la preparación del SUV. EW reconoce el apoyo financiero de Emergence Sorbonne University, LLP reconoce el apoyo de Agence Nationale de la Recherche (BOAT, ANR-17-CE30-0001) y de Emergence(s) Ville de Paris.

Universidad de la Sorbona, CNRS, Instituto de Biología Paris-Seine (IBPS), Laboratorio Jean Perrin (LJP), 4 place Jussieu, 75005, París, Francia

Pierre Tapie, Alexis M. Prevost, Lorraine Montel, Léa-Laetitia Pontani y Elie Wandersman

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

EW y LLP concibieron el proyecto y los experimentos, analizaron los resultados y escribieron el documento, PT recopiló los datos experimentales, analizó los resultados y revisó el manuscrito. LM participó en la recopilación de datos experimentales, analizó los resultados y revisó el manuscrito. AP participó en el desarrollo de la configuración experimental, analizó los resultados y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Léa-Laetitia Pontani o Elie Wandersman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Tapie, P., Prevost, AM, Montel, L. et al. Un método simple para hacer, atrapar y deformar una vesícula en un gel. Informe científico 13, 5375 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

Descargar cita

Recibido: 13 julio 2022

Aceptado: 21 de marzo de 2023

Publicado: 02 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.