Blog

Jun 01, 2023

inductor

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19445 (2022) Citar este artículo

927 Accesos

3 citas

Detalles de métricas

Trichoderma reesei es un huésped ampliamente utilizado para producir cócteles de celulasa y hemicelulasa para la degradación de la biomasa lignocelulósica. Aquí, informamos una estrategia de modificación genética para T. reesei industrial que permite la producción de enzimas utilizando glucosa simple sin inductores, como celulosa, lactosa y soforosa. Anteriormente, se sabía que el XYR1V821F o XYR1A824V mutado inducía la xilanasa y la celulasa usando solo glucosa como fuente de carbono, pero su composición enzimática estaba sesgada hacia las xilanasas y su rendimiento era insuficiente para degradar la lignocelulosa de manera eficiente. Por lo tanto, examinamos combinaciones de XYR1V821F mutado y CRT1, BGLR, VIB1, ACE2 o ACE3 expresados ​​constitutivamente, conocidos como reguladores de celulasa y factores esenciales para la expresión de celulasa en la cepa E1AB1 de T. reesei que ha sido altamente mutagenizada para mejorar la productividad enzimática y expresar una ß-glucosidasa para un alto rendimiento enzimático. Los resultados mostraron que la expresión de ACE3 a la cepa que expresa XYR1V821F mutada promovió la expresión de celulasa. Además, la coexpresión de estos dos factores de transcripción también resultó en una mayor productividad, con una productividad enzimática 1,5 veces mayor que con la expresión única convencional de XYR1V821F mutado. Además, esa productividad fue 5,5 veces mayor en comparación con la productividad con una expresión única mejorada de ACE3. Además, aunque el dominio de unión al ADN de ACE3 se había considerado esencial para la producción de celulasa sin inductores, descubrimos que ACE3 con un dominio de unión al ADN parcialmente truncado era más eficaz en la producción de celulasa cuando se coexpresaba con un XYR1V821F mutado. Este estudio demuestra que la coexpresión de los dos factores de transcripción, el XYR1V821F o XYR1A824V y ACE3 mutados, dio como resultado una composición enzimática optimizada y una mayor productividad.

Reemplazar los combustibles fósiles con fuentes de energía renovables y ambientalmente limpias es esencial para construir una sociedad sostenible. La biomasa lignocelulósica es la materia prima sostenible más abundante para la producción de biorrefinerías y biocombustibles. Por lo tanto, la utilización efectiva de biomasa lignocelulósica podría ayudar a abordar el problema1,2.

Para utilizar la biomasa lignocelulósica como materia prima, es necesario hidrolizar la biomasa lignocelulósica en azúcares simples usando celulasa y hemicelulasa. Las celulasas y hemicelulasas extracelulares para la degradación de biomasa lignocelulósica son producidas principalmente por hongos filamentosos3. Especialmente el hongo filamentoso Trichoderma reesei (teleomorfo Hypocrea jecorna) es un microorganismo bien conocido que produce grandes cantidades de enzimas mixtas de celulasa extracelular y hemicelulasa para la degradación de la biomasa lignocelulósica4,5. Se esperaba que fuera el pilar de la producción comercial de celulasa, teniendo en cuenta los informes de que las cepas industriales de T. reesei se pueden utilizar para obtener hasta más de 80 g/L de proteína extracelular4,6,7,8. Sin embargo, la hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica requiere grandes cantidades de enzimas lignocelulósicas, y el alto costo de las enzimas se reconoce como un cuello de botella importante en la producción de biocombustibles lignocelulósicos9,10,11,12.

Una de las mejores soluciones es mejorar la capacidad de producción de enzimas y utilizar fuentes de carbono económicas como la glucosa. Por lo tanto, los mecanismos reguladores de la expresión de celulasa deben entenderse bien. Sin embargo, la expresión de la celulasa está complejamente regulada por varios factores de transcripción (TF), que pueden influir directa o indirectamente en la expresión del gen de la celulasa13. Por lo tanto, los roles específicos de varios factores y su red regulatoria completa aún no se comprenden completamente. Estudios previos han demostrado el papel de varios reguladores de la celulasa. Mientras que XYR1, HAP2/3/5, ACE2, VEL1, ACE3, ARE1, CRZ1, STR1 y VIB1 son reguladores positivos, CRE1, ACE1, RCE1, CTF1, LAE1 y PAC1 se identifican como reguladores negativos14,15. La expresión del gen de la celulasa requiere la liberación de la represión de catabolitos de carbono (CCR)16. Por lo tanto, la modificación de los reguladores de celulasa mediante tecnología genética se considera eficaz.

El represor transcripcional CRE1 es un regulador clave de la CCR y se sabe que inhibe indirectamente la expresión de celulasa en hongos filamentosos en presencia de glucosa16. En Trichoderma, el truncamiento17, la deleción18 o la mutagénesis dirigida a múltiples sitios19 de cre1 alivia la CCR. Por lo tanto, es posible mejorar notablemente la expresión del gen de la celulasa en presencia de diversas fuentes de carbono, como glucosa, lactosa, soforosa y celulosa20,21,22,23. En particular, la eliminación o el truncamiento de cre1 conduce a una desrepresión parcial de la celulasa y la hemicelulasa cuando las cepas con mutación de CRE1 se cultivan en un medio que contiene glucosa16,17,18,24. Sin embargo, en un medio que contiene solo glucosa sin azúcares inductores, la cepa mutada CRE1 no puede liberar completamente el CCR. Por lo tanto, reprime la expresión o no reprime ni activa la celulasa o la hemicelulasa, lo que da como resultado una baja producción de celulasa. Además, los represores ace125 y rce126, así como cre1, pueden eliminarse para mejorar los niveles de expresión del gen de la celulasa, pero se supone que los inductores son necesarios para la expresión.

Por el contrario, XYR1, un regulador positivo requerido para expresar la mayoría de los genes de celulasa y hemicelulasa, condujo al potencial de expresar estos genes sin inductores mediante modificación. XYR1 tiene un dominio de unión a ADN de tipo Zn(II)2Cys6, que se une directamente a las regiones aguas arriba de los genes de celulasa/hemicelulasa27,28. La interrupción de xyr1 conduce a un fenotipo negativo de celulasa29, lo que indica que es un factor esencial para la inducción de celulasa. XYR1 promueve una mayor expresión del gen de la celulasa en condiciones de sobreexpresión constitutiva, mientras que no aumenta la producción de celulasa en medios con glucosa como única fuente de carbono12. También se ha implementado la ingeniería de TF para aumentar la expresión de celulasa. A pesar de los TF artificiales que fusionan XYR1 con otros factores de transcripción que se han desarrollado e intentado producir celulasa de forma constitutiva utilizando glucosa como única fuente de carbono, la productividad de la proteína no ha llevado a la producción inducida30,31. La cepa que expresa XYR1V821F o XYR1A824V mutada expresó xilanasa y celulasa incluso en glucosa como la única fuente de carbono y mejoró la productividad de proteína8,32,33. Sin embargo, las enzimas inducidas por los XYR1V821F o XYR1A824V mutados no fueron suficientes para la degradación eficiente de la lignocelulosa debido a su alta composición de xilanasa y baja celulasa32,33. Por lo tanto, para producir celulasa/hemicelulasa a niveles similares al estado inducido incluso en medios con glucosa como única fuente de carbono, asumimos que es necesario agregar factores que activen la expresión de celulasa trabajando en cooperación con XYR1, y buscamos factores cooperativos expresar con XYR1V821F mutado.

Los activadores de transcripción ACE234, ACE335 y VIB136 fueron factores cooperativos putativos. Además, se consideró como tal a CRT137,38, un transportador sensible a la celulosa implicado en la regulación de la expresión del gen xyr1, y BGLR39, un activador de la β-glucosidasa.

ACE2 es un factor de transcripción que mejora la activación transcripcional de cbh1, cbh2, egl1, egl2 y xyn2 en T. reesei con inducción de celulosa34. Sin embargo, ACE2 no está involucrado en la inducción de sophorose. ACE2 se une al mismo motivo promotor compartido con XYR1, y la fosforilación y la dimerización son requisitos previos para la unión de ACE2 a su promotor diana40.

En T. reesei, se sabe que ACE3 participa en la producción de celulasa tras la inducción con lactosa35. ACE3 interactúa con XYR1 para iniciar la producción de celulasa41. La introducción de múltiples copias del gen de ace3 mejora la expresión del gen de la celulasa y regula la expresión del gen de la xilanasa35. Además, la ACE3 truncada C-terminal puede inducir altos niveles de expresión de celulasa y hemicelulasa en condiciones no inducidas usando glucosa y mejorar aún más la expresión en condiciones inducidas usando lactosa o una mezcla de glucosa-soflosa42,43. Muestra una inducción mejorada de celulasa tanto en presencia como en ausencia de un inductor. Además, la cepa que sobreexpresa XYR1 de tipo salvaje o XYR1A824V mutado y ACE3 truncado C-terminal mejoró la proteína secretada total con lactosa como fuente de carbono. Sin embargo, cuando se usó glucosa como única fuente de carbono, la sobreexpresión adicional de XYR1A824V mutado además de ACE3 truncado C-terminal no dio como resultado una mejora adicional42.

En T. reesei, VIB1 también es esencial para la producción de celulasa y actúa como un importante regulador de la inducción de celulasa36,44. Una comparación de los transcriptomas Δvib1 y Δxyr1 usando celulosa como fuente de carbono mostró una alta frecuencia de superposición entre los genes inducidos por celulosa regulados por objetivos VIB1 y XYR145. Esto sugiere que VIB1 regula parcialmente la expresión del gen de la celulasa a través de XYR145.

CRT1 ha sido considerado uno de los transportadores más importantes involucrados en la inducción de celulasa en T. reesei37,38. Se descubrió que su deleción suprimía por completo la expresión del gen de la celulasa tras la inducción con celulosa y lactosa38. Recientemente, CRT1 fue validado para transportar lactosa, celobiosa, glucosa y soporosa46. Además, cuando se sobreexpresa XYR1 en condiciones que contienen glucosa, la transcripción de crt1 se mantiene en un nivel relativamente bajo47.

BGLR, un activador de la β-glucosidasa, es un factor de transcripción que tiene un dominio de unión al ADN de tipo Zn(II)2-Cys639. Una función de BGLR es regular positivamente ciertos genes de β-glucosidasa39. El mutante eliminado del gen bglr mostró una mayor producción de celulasa durante el crecimiento de la celobiosa.

Examinamos si el XYR1V821F mutado y cada uno de los cinco factores supuestamente asociados con él afectan la regulación de la producción de celulasa y hemicelulasa en condiciones libres de inductor utilizando glucosa como fuente de carbono.

Utilizamos una cepa derivada de PC-3-7, una cepa productora de enzimas de alto rendimiento de T. reesei que es más productiva y tiende a aliviarse de la CCR en glucosa48,49,50. Se sabe que T. reesei secreta un conjunto completo de celulasas cuando se cultiva con inductores como celulosa, celobiosa y soforosa5,51. Por el contrario, se sabe que las actividades de CBH y EG de T. reesei son más altas que las de otros microorganismos, pero su actividad de BGL es más baja que la de las mezclas de celulasa de otros organismos52. Esto da como resultado la acumulación de celobiosa y la subsiguiente inhibición del producto de CBH, lo que reduce la eficiencia de la hidrólisis enzimática. Para resolver este problema, la adición de BGL es eficaz para mejorar el rendimiento de la enzima. Los costos de producción se pueden reducir sobreexpresando el BGL en T. reesei. La cepa E1AB1 tiene un gen de β-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (Aabgl) en la cepa PC-3-752,53,54.

Nuestro objetivo fue desarrollar una cepa que no requiera un inductor para la producción de celulasa utilizando E1AB1 como una cepa productora de enzimas más práctica. Intentamos expresar la celulasa mediante la coexpresión de los cinco factores candidatos y XYR1V821F mutado, que induce la producción de xilanasa de alto nivel en condiciones no inductoras. En este estudio, el defecto de inducción insuficiente de celulasa se eliminó mediante la expresión constitutiva de XYR1V821F y ACE3 mutados. Por lo tanto, informamos que la producción económica de enzimas de sacarificación se puede lograr sin inductores de celulasa.

Para combinar la expresión de XYR1V821F mutado y sus factores cooperativos candidatos, se requirieron dos sitios de inserción genómica para expresar XYR1V821F mutado y cada factor. Por lo tanto, utilizamos las regiones del gen ace1 y rce1 que codifican represores transcripcionales como sitios de inserción.

En primer lugar, se realizó la interrupción de los genes represores ace1 y rce1 para confirmar el efecto de la deleción. Los resultados mostraron que la productividad de proteína de las cepas E1AB1, Δace1 y Δrce1 se redujo a menos del 10 % en condiciones no inductoras con glucosa como fuente de carbono en comparación con las condiciones inductoras con celulosa como fuente de carbono en la cepa E1AB1 parental (Fig. .1a). Además, la interrupción de ace1 o rce1 no alteró la composición de las proteínas secretoras como se muestra en la Fig. 1b. Se encontró una banda de alta intensidad indicada por una flecha abierta (Fig. 1b, carriles 2–4) y se identificó como una proteína de la familia glucósido hidrolasa 55 (GH55) (Trire2_121746) mediante análisis nano LC-MS/MS. Se encontró que esta proteína era similar a la β-1,3-glucanasa Lam55A de Phanerochaete chrysosporium (Archivo adicional Tabla S1). Esto indica que se observó poca producción de celulasa en las tres cepas con glucosa como única fuente de carbono.

Efectos de la expresión constitutiva de XYR1 mutado en V821F y la interrupción de los represores en el cultivo de glucosa. (a) Proteína extracelular del cultivo de muestras después de 72, 96 y 120 h. La cepa E1AB1 de Trichoderma reesei se cultivó en matraces de agitación en un medio inductor que contenía 3 % de celulosa, y las cepas recombinantes E1AB1Δace1, E1AB1Δrce1, E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F) y E1AB1-XΔrce1 se cultivaron en un medio no inductor que contenía 3 % de glucosa. ( b ) Análisis SDS-PAGE de las proteínas secretadas después de 72 h. Cepa E1AB1 de T. reesei con cultivos de celulosa al 3 % (carril 1) y glucosa al 3 % (carril 2), y cepas recombinantes E1AB1Δace1 (carril 3), E1AB1Δrce1 (carril 4), E1AB1-X (carril 5) y E1AB1-XΔrce1 (carril 6) con cultivos de glucosa al 3%. La punta de flecha abierta indica lo confirmado en cultivo de glucosa (carriles 2–4). Las puntas de flecha cerradas indican proteínas claramente sobreexpresadas, probablemente correspondientes a la xilanasa principal (BXL1, XYN1, XYN2, carriles 5 y 6). El gel se recortó en el rango de 15 a 250 kDa y el gel original se mostró en el archivo adicional Fig. S4. Las barras de error indican las desviaciones estándar. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. ** p < 0,01.

Seleccionamos el promotor act1 como un promotor constitutivo no afectado por la utilización de la fuente de carbono, que mostró niveles de expresión similares a los de la piruvato descarboxilasa 1 (Trire2_121534) en los resultados de RNAseq obtenidos en condiciones de cultivo que contienen celulosa y glucosa en la cepa E1AB154. Se introdujo un casete que tenía XYR1V821F bajo el promotor act1 constitutivamente activo en el locus ace1, y la cepa se denominó E1AB1-X. La cepa E1AB1-X produjo 2,08 g/L de proteína extracelular en condiciones no inductoras. Este fue un aumento de cuatro veces en la producción de proteína extracelular en comparación con la cepa parental (Fig. 1a). Además, se observaron diferencias en los patrones de bandas en el análisis SDS-PAGE (Fig. 1b, puntas de flecha cerradas). Según los pesos moleculares estimados y un informe anterior53, las bandas de proteína probablemente correspondían a las principales xilanasas (XYN1, XYN2) y β-xilosidasa (BXL1; Fig. 1b, carril 5). Sin embargo, su composición era diferente a la de las proteínas producidas por la cepa parental E1AB1 en condición inductora (Fig. 1b, carriles 1 y 5), y las intensidades de banda correspondientes a las celulasas (CBH1, CBH2, EG1) también eran bajas.

Por lo tanto, las xilanasas podrían producirse mediante la expresión constitutiva del XYR1V821F mutado incluso en condiciones sin inductor; sin embargo, las celulasas no se produjeron completamente. La interrupción adicional del gen rce1 en la cepa E1AB1-X resultó en una mayor productividad de proteínas (Fig. 1a), pero no hubo cambios significativos en la composición de la enzima (Fig. 1b, carril 6). Por lo tanto, se usó el locus rce1 para probar la mejora de la productividad de la celulasa al coexpresar los factores cooperativos candidatos para la producción de celulasa.

La recombinación homóloga de crt1, bglr, vib1, ace2 y ace3, activadores de celulasa y factores esenciales para la expresión de celulasa se realizó en el locus rce1 del genoma E1AB1-X, seguida de expresión constitutiva bajo el promotor act1. La coexpresión constitutiva de CRT1, BGLR, VIB1 o ACE2 en la cepa E1AB1-X no produjo cambios significativos en la concentración de proteína secretada (Fig. 2a) y las bandas con pesos moleculares correspondientes a celulasas como CBH1, CBH2 (Fig. 2b, carriles 2–5). Por el contrario, la cepa que expresa constitutivamente ACE3, E1AB1-XA3, mostró un aumento de 1,5 veces en la producción de proteínas en comparación con E1AB1-X (Fig. 2a). El análisis de la composición enzimática reveló una banda disminuida correspondiente a las xilanasas (XYN1, XYN2 y BXL1) y algunas bandas con mayor intensidad, como lo indican las flechas cerradas en E1AB1-XA3 (Fig. 2b, carril 6). Estas bandas, identificadas mediante análisis nano LC-MS/MS, eran principalmente celulasas (CBH1, CBH2 y EG1), xilanasas (BXL1 y XYN4) y pequeñas cantidades de proteínas involucradas en la degradación de la celulosa (SWO1, CIP2 y EG4) (Archivo adicional Cuadro S2).

Coexpresión de factores implicados en la transcripción de celulasas en la cepa E1AB1-X. La cepa E1AB1-X de Trichoderma reesei se coexpresó con varios factores relacionados con la expresión de celulasa y se cultivó en matraces de agitación en un medio no inductor que contenía glucosa al 3 %. ( a ) Proteína extracelular de muestras de cultivo después de 96 h. ( b ) Análisis SDS-PAGE de las proteínas secretadas después de 72 h en un cultivo de glucosa de T. reesei E1AB1-X (carril 1, Δace1-Pact1-xyr1V821F, como control), E1AB1-XC (carril 2, Δace1-Pact1- xyr1V821F y Δrce1-Pact1-crt1), E1AB1-XB (carril 3, Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-bglr), E1AB1-XV (carril 4, Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-vib1), E1AB1 -XA2 (carril 5, Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-ace2) y E1AB1-XA3 (carril 6, E1AB1-XA3, Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-ace3(PT)). El gel se recortó en el rango de 15 a 250 kDa y el gel original se mostró en el archivo adicional Fig. S5. ( c ) Actividad enzimática volumétrica del sobrenadante de cultivo de 72 h. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de p-nitrofenol por minuto por ml de sobrenadante de cultivo a partir del sustrato a 50 °C. Los gráficos de barras muestran la actividad relativa a la de E1AB1-X. Las barras de error indican las desviaciones estándar. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas. ** p < 0,01.

Para medir la actividad enzimática del sobrenadante de cultivo de la cepa que coexpresa constitutivamente ACE3, se midió pNPLase para actividad CBH1 y pNPGase para actividad BGL. Los resultados mostraron que la cepa E1AB1-XA3 fue 4,9 veces mayor en pNPLase y 5,5 veces mayor en pNPGase en comparación con la cepa E1AB1-X. En la cepa E1AB1, la β-glucosidasa de A. aculeatus (Aabgl1) se expresa utilizando el promotor egl1. El aumento en la actividad de pNPGase sugiere una transcripción mejorada del promotor egl1 en la cepa E1AB1-XA3. Estos valores de actividad de pNPGase y pNPLase, que indican actividad de celulasa, aumentaron aproximadamente cinco veces. Mientras que los valores de actividad de pNPXasa y pNPX2asa, que indican actividad de xilanasa, cambiaron hasta 1,8 y 0,8 veces. El hecho de que la actividad de la xilanasa no mejorara mucho, a diferencia de la celulasa, sugiere que ACE3 contribuye a una mejora específica en la expresión de la celulasa.

Además, la banda de GH55 observada en condiciones no inducibles (Fig. 1b, carriles 2–4 con punta de flecha abierta) desapareció en el sobrenadante de la cepa que expresaba ACE3 de forma constitutiva. Lam55A, que hidroliza el β-1,3-glucano, podría regular el metabolismo de fuentes externas de nutrientes55. Por tanto, se infirió que las celulasas se inducían en la cepa E1AB1-XA3 incluso en ausencia de inductores, y la cepa se asemejaba al estado activamente inducido para la producción de celulasa. En consecuencia, encontramos que la cepa E1AB1-XA3, que combina la expresión constitutiva de XYR1V821F y ACE3 mutados, permite producir xilanasas y un alto rendimiento de celulasas, incluso en condiciones libres de inductores.

La cepa E1AB1-XA3 tenía una alta productividad de celulasa incluso en ausencia de inductores, lo que indica que una combinación de ACE3 y XYR1V821F mutado es eficaz para aumentar la actividad de la celulasa (Fig. 2). Además de la mutación V821F, se informó anteriormente que la mutación A824V es una de las mutaciones XYR1 que permiten la expresión de xilanasa y celulasa sin inductores32. Por lo tanto, para confirmar los mutantes XYR1 potencialmente útiles, se evaluaron los mutantes V821F y A824V con un fenotipo ciego a la glucosa junto con el tipo salvaje (Fig. 3a). Por el contrario, los informes han sugerido que existe la posibilidad de múltiples sitios de inicio de transcripción en ace341,43. El ace3 de E1AB1-XA3 utilizado en la Fig. 2 se derivó de la base de datos del genoma JGI (Las secuencias ORF (651 o 629 aminoácidos) presentadas en http://genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html ) por referencia. Sin embargo, se propusieron intrones correctos y dos sitios de inicio de transcripción putativos41,43. La secuencia de aminoácidos completa estimada fue de 734 aminoácidos, y la secuencia registrada en JGI fue un dominio de unión a ADN N-terminal parcialmente truncado. Por lo tanto, clonamos ambos sitios de inicio de traducción putativos del ADN genómico y examinamos la expresión constitutiva de ACE3 parcialmente truncado (PT-ACE3) y ACE3 de longitud completa (FL-ACE3) (se proporcionan más detalles en el archivo adicional Fig. S1). Además, realizamos la expresión constitutiva de XYR1 y ACE3 usando recombinación no homóloga para encontrar si la interrupción de los dos represores (ace1 y rce1) era esencial. Las cepas, las fuentes de carbono y los genotipos utilizados en este estudio se enumeran en el archivo adicional, Tabla S3.

Confirmación de las combinaciones genéticas requeridas para una alta producción de celulasa en condiciones libres de inductores. (a) Dominio putativo de XYR1 y ACE3 utilizado en el estudio, mutaciones de aminoácidos en XYR1 y la supuesta variante de ACE3. Los cultivos en matraces de agitación se realizaron utilizando celulosa al 3 %: Calle 1 y glucosa al 3 %: Calle 2–9. Las cepas utilizadas en esta figura fueron carril 1 y 2: E1AB1, carril 3: E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F), carril 4: E1AB1-A3 (Δrce1-Pact1-ace3(PT)), carril 5: E1AB1- XA3 (Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-ace3(PT)), carril 6: E1AB1-XA3fl (Δace1-Pact1-xyr1V821F y Δrce1-Pact1-ace3(FL)), carril 7: E1AB1-XA3nhr (Pact1- xyr1V821F y Pact1-ace3(PT) por recombinación no homóloga), Carril 8: E1AB1-X824A3nhr (Pact1-xyr1A824V y Pact1-ace3(PT) por recombinación no homóloga) y Carril 9: E1AB1-XwtA3nhr (Pact1-xyr1WT y Pact1-ace3 (PT) por recombinación no homóloga). Las fuentes de carbono, las cepas y los genotipos utilizados en esta figura se organizaron en un archivo adicional, Tabla S3. ( b ) SDS-PAGE de proteínas secretadas después de 72 h de cultivo (2, 5 μg de proteína / carril). El gel se recortó en el rango de 15 a 250 kDa y el gel original se mostró en el archivo adicional Fig. S6. ( c ) Concentración de proteína extracelular a las 96 h. Niveles de transcripción relativos de xyr1 (d) y ace3 (e). La PCR en tiempo real se realizó en las muestras tomadas a las 48 h. Los niveles transcripcionales de las cepas pgk1 y E1AB1 en cultivo de glucosa se midieron para el cálculo de referencia y la normalización de datos, respectivamente, y se analizaron mediante el método ΔΔCt. Las barras de error indican las desviaciones estándar. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. **a indicó p < 0,01 para la prueba con el carril 5 (E1AB1-XA3) y **b indicó p < 0,01 para la prueba con el carril 7 (E1AB1-XA3nhr).

En todas las cepas que expresan constitutivamente ACE3, la composición enzimática de las proteínas secretadas fue principalmente celulasa (Fig. 3b, carriles 4, 5, 6, 7, 8 y 9). La producción total de proteínas de la cepa E1AB1-A3 que expresa PT-ACE3 (Fig. 3c, carril 4) y la cepa E1AB1-XwtA3 que coexpresa ACE3 con XYR1 de tipo salvaje (Fig. 3c, carril 9) fue de 0,57 g/l. y 0,51 g/L, respectivamente. Estos resultados indicaron que la coexpresión de ACE3 con el XYR1V821F mutado fue eficaz para una alta productividad. Para que se combine un XYR1 mutado, no es necesario que sea específico de V821F, pero al menos debe exhibir un fenotipo ciego a la glucosa como XYR1V821F o XYR1A824V mutado (Fig. 3b, c, carriles 7 y 8). Además, la coexpresión de ACE3 fue efectiva con secuencias truncadas parciales y de longitud completa, las cuales tenían una composición dominada por celulasa y mostraron una mayor productividad que una sola expresión de XYR1V821F (Fig. 3b,c, carril 6). Sin embargo, la productividad de la cepa E1AB1-XA3fl con FL-ACE3 fue un 14 % menor que la de la cepa E1AB1-XA3 con PT-ACE3 (Fig. 3c, carril 5). Este resultado fue sorprendente ya que ACE3 con un dominio de unión al ADN parcialmente truncado tuvo una productividad superior. La expresión de XYR1V821F y ACE3 mutados por recombinación no homóloga (Fig. 3c, Calle 7, cepa E1AB1-XA3nhr) mostró el mismo efecto de coexpresión que antes. Sin embargo, la productividad de la proteína fue menor que en ace1, y rce1 interrumpió las cepas E1AB1-XA3 (Fig. 3c, carril 5).

Los niveles de transcripción de xyr1 y ace3 se compararon en las nueve cepas enumeradas en la Tabla S3. La transcripción total de xyr1 se midió con un par de cebadores en las regiones no mutadas y se midió específicamente para WT, V821F y A824V mediante el diseño de un cebador inverso en la posición mutada. Los cebadores utilizados para medir las transcripciones de ace3 se diseñaron contra secuencias comunes para todos los ace3 y en secuencias únicas de longitud completa (exón 2) o truncadas parciales (dentro del intrón 2 al exón 3) (Archivo adicional Tabla S4). Por lo tanto, los niveles de transcripción de xyr1 aumentaron 11,5 veces en la cepa E1AB1-X, expresando constitutivamente el XYR1V821F mutado en comparación con la cepa E1AB1 original en el medio con glucosa como fuente de carbono. El aumento no fue solo en xyr1V821F sino también en xyr1WT (xyr1 nativo) en 4,2 veces (Fig. 3d, carriles 2 y 3). Además, la transcripción total de ace3 aumentó 6,2 veces en la cepa E1AB1-X, aunque la expresión de ace3 no mejoró directamente (Fig. 3e). Esto indica que la expresión de xyr1 y ace3 nativos se mejora significativamente directa/indirectamente por XYR1V821F mutado. Además, en la cepa E1AB1-XA3 que coexpresa xyr1V821F y PT-ace3 mutados, los niveles totales de transcripción de xyr1 y ace3 aumentaron hasta 16,8 y 8,9 veces, respectivamente, en comparación con la cepa original (Fig. 3d, e, carril 5 ). En el caso de la coexpresión de xyr1WT y PT-ace3 sin utilizar xyr1 mutado (cepa E1AB1-XwtA3nhr), los niveles de transcripción total de xyr1 y ace3 aumentaron 6,7 veces (Fig. 3d, carril 9) y 3,7 veces (Fig. 3e, carril 9), respectivamente. Sin embargo, los niveles totales de proteína secretada no aumentaron (Fig. 3c, carril 9). Estos resultados sugirieron que se requería un cierto nivel de XYR1 total o XYR1 mutado, como XYR1V821F o XYR1A824V mutado, para una producción alta de celulasa.

Estos resultados también indicaron que la expresión constitutiva del XYR1 mutado que exhibe un fenotipo ciego a la glucosa (como V821F, A824V) y ACE3 (longitud total y parcial truncada) era necesaria para una producción alta de celulasa en ausencia de inductores. Además, el truncamiento parcial del dominio de unión al ADN de ACE3 y las interrupciones de ace1 y rce1 contribuyeron a una alta productividad proteica, y se descubrió que el genotipo de la cepa E1AB1-XA3 era la combinación más eficaz en este estudio.

Analizamos la expresión génica y la actividad de celulasa y xilanasa en una sola expresión de XYR1V821F (cepa E1AB1-X), una sola expresión de PT-ACE3 (cepa E1AB1-A3) y coexpresión de XYR1V821F y PT-ACE3 (E1AB1 -XA3 cepa).

Debido al efecto de la mutación XYR1V821F, la transcripción de las principales celulasas en la cepa E1AB1-X fue aproximadamente cuatro órdenes de magnitud mayor que la de la cepa original E1AB1 (Fig. 4a). Además, en la cepa E1AB1-XA3, la expresión constitutiva de PT-ACE3 resultó en un aumento adicional de 6,4 veces en los niveles de transcripción de celulasa en comparación con la cepa E1AB1-X (Fig. 4a). El aumento en la expresión de las principales xilanasas, xyn1 y xyn2 fue un máximo de 1,7 veces (Fig. 4a), lo que concordaba con su actividad enzimática (Fig. 4b). De acuerdo con estos resultados, las enzimas producidas por la cepa E1AB1-XA3 exhibieron una cantidad similar de xilanasa y un aumento específico en los componentes de celulasa (CBH1, CBH2, EG1) en comparación con la cepa E1AB1-X (Fig. 4c). La composición de celulasa/xilanasa de la cepa E1AB1-XA3 en el cultivo no inducido usando glucosa fue similar a la del cultivo inducido de la cepa E1AB1 original usando celulosa (Fig. 4b, archivo adicional Fig. S2). En la cepa E1AB1-A3, las actividades de degradación de pNPX2ase y pNPXase se detectaron poco (Fig. 4b), y las bandas de BXL1, XYN1 y XYN2 pudieron identificarse poco (Fig. 3b, Carril No.4). Por lo tanto, la expresión única constitutiva de ACE3 podría activar la producción de celulasa pero no podría activar completamente la producción de xilanasa (Fig. 3c). Además, según las concentraciones y la composición de proteínas estimadas a partir de SDS-PAGE, las cantidades absolutas de CBH1, CBH2 y EG1 fueron 0,24, 0,34 y 1,25 g/l en las cepas E1AB1-X, -A3 y -XA3, respectivamente. Esto confirma una regulación positiva sinérgica de la celulasa tras la coexpresión de XYR1V821F y ACE3 mutados (Fig. 4c).

Análisis de expresión génica, actividad enzimática, composición y sacarificación de celulosa microcristalina. ( a ) Expresión génica relativa de las principales celulasas y xilanasas. La PCR en tiempo real se realizó en la muestra de cultivo de 48 h con glucosa como fuente de carbono. Los niveles transcripcionales de pgk1 y E1AB1-X cepa de ARN se midieron para el cálculo de referencia y la normalización de datos, respectivamente, y se analizaron mediante el método ΔΔCt. (b) La actividad volumétrica de cada enzima en el sobrenadante de cultivo obtenido después de 72 h de cultivo con glucosa como fuente de carbono. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de p-nitrofenol por minuto por ml de cultivo del sobrenadante del sustrato a 50 °C. Los gráficos de barras muestran la actividad relativa a E1AB1-X. (c) La concentración de cada componente enzimático se calculó a partir de la composición enzimática y la concentración total de proteína secretada. Las composiciones se calcularon a partir de los patrones de bandas siguiendo SDS-PAGE (consulte el archivo adicional Fig. S2) derivados de E1AB1 (cultivo con celulosa: C y glucosa: G), E1AB1-X (G), E1AB1-A3 (G) y Cepas E1AB1-XA3 (G). Las concentraciones de proteína se determinaron a partir del valor de 96 h. (d) Sacarificación de celulosa microcristalina utilizando la misma dosis de proteína (2,0 mg de proteína/g de celulosa). (e) Sacarificación de celulosa microcristalina utilizando el mismo volumen de sobrenadante de cultivo (0,87 ml de sobrenadante de cultivo/g de celulosa). Las barras de error indican las desviaciones estándar. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. **p < 0,01, *p < 0,05.

La sacarificación de la celulosa microcristalina se evaluó utilizando enzimas producidas en condiciones inductoras utilizando celulosa o en condiciones no inductoras utilizando glucosa. En la evaluación usando 2,0 mg de enzima por g de celulosa, la enzima producida por la cepa original E1AB1 inducida con celulosa liberó la mayor cantidad de glucosa a 26,8 g de glucosa/L. Por el contrario, la enzima producida por la cepa E1AB1-XA3 fue la mejor en la condición no inductora con 22,5 g-glucosa/L (Fig. 4d). La enzima de la cepa E1AB1-A3 liberó 17,8 g-glucosa/L. Este resultado fue 2,3 veces mayor que el de la enzima de la cepa E1AB1-X (Fig. 4d). Inferimos que esto quizás se debió a la alta proporción de composición de los componentes de celulasa dentro de la proteína. Sin embargo, como se describió anteriormente, la cantidad total de enzimas secretadas producidas por la cepa E1AB1-A3 fue de 0,57 g/L (Fig. 4c), y la cantidad absoluta de celulasa fue de 0,34 g/L. Por el contrario, el cóctel de enzimas derivado de la cepa E1AB1-X contenía una concentración de proteína de 2,09 g/L y era más productivo que E1AB1-A3, pero estaba compuesto principalmente por xilanasas; como resultado, la cantidad absoluta de celulasas fue de 0,24 g/L. Por lo tanto, el componente de celulasa producido por las cepas E1AB1-A3 y E1AB1-X fue menor que el de la cepa E1AB1-XA3, 1,25 g/L. Por lo tanto, la sacarificación se realizó utilizando 0,87 mL del mismo volumen de sobrenadante de cultivo. Los resultados mostraron que la enzima de la cepa E1AB1-A3 liberó 6,5 g de glucosa/L, y la enzima de la cepa E1AB1-X liberó 7,5 g de glucosa/L, y las dos enzimas tuvieron un rendimiento comparable. Por el contrario, la enzima de la cepa E1AB1-XA3 liberó una cantidad significativamente mayor, 19,9 g-glucosa/L (Fig. 4e). Esto sugiere que la cepa E1AB1-XA3 puede producir una enzima mejor que la cepa de sobreexpresión XYR1V821F existente en condiciones sin inductor.

Se encontró que la cepa E1AB1-XA3 tenía dos fenotipos importantes: aumento de la relación de composición de celulasa mediante la expresión constitutiva de ACE3 y alta productividad de proteínas en condiciones no inductoras mediante la introducción de XYR1V821F mutado. Por lo tanto, podríamos lograr la propiedad más crucial de la enzima celulolítica, que es el aumento de la producción de celulasa en un sistema de producción no inductor.

El sistema de producción de enzimas sin inductor informado anteriormente por T. reesei usando XYR1V821F o XYR1A824V mutado produjo principalmente xilanasa, con una activación débil de la expresión de celulasa32,33. Por lo tanto, desarrollamos una estrategia de modificación genética para producir tanto celulasa como xilanasa al mismo nivel que en condiciones inducidas. Como resultado, pudimos generar con éxito grandes cantidades de celulasa y xilanasa sin inductores. La productividad de celulasa mejorada utilizando glucosa como única fuente de carbono se logró mediante la expresión constitutiva de XYR1V821F o XYR1A824V y ACE3 mutados, especialmente ACE3, que tienen un dominio de unión al ADN parcialmente truncado.

En este informe, la coexpresión de XYR1V821F con factores relacionados con la regulación de celulasa, CRT1, BGLR, VIB1 o ACE2, no aumentó la expresión de celulasa (Fig. 2). Anteriormente, se informó que la eliminación de estos factores causaba la pérdida o reducción de la expresión de celulasa38,39,40,45. Estos factores también se vieron afectados por la expresión mejorada de XYR1 y ACE3 (por ejemplo, crt1 está regulado por ACE338,47). Esto sugirió que el efecto de la coexpresión de XYR1V821F con estos factores puede no haber ocurrido porque cantidades suficientes de estos factores ya estaban reguladas al alza por la expresión constitutiva de XYR1V821F mutado y la regulación al alza posterior de ACE3 (Fig. 3e, Carril No. 3). Por el contrario, se observó que el efecto de la coexpresión de ACE3 contribuye a mejorar la producción de celulasa (Fig. 2), lo que sugiere que es necesario mejorar la expresión de ACE3 más allá de la regulación positiva por XYR1V821F mutado. Anteriormente se informó que ACE4 se une directamente al promotor ace3 y regula la expresión de ACE3 para promover la producción de celulasa56. Posiblemente, ACE3 esté regulado no solo por XYR1 sino también por otros factores, incluido ACE4, lo que sugiere que la expresión mejorada de ACE3 por factores distintos de XYR1 puede ser la clave para la expresión de celulasa. Además de la regulación de la expresión principal de celulasa/hemicelulasa, también es posible que no se expresaran enzimas menores (que no están bajo el control de XYR1 y ACE3), y un análisis más completo del perfil de expresión de varios reguladores y familias de glucósidos hidrolasas requiere una intervención futura.

XYR1 se ha estudiado como uno de los reguladores clave de la producción de celulasa y xilanasa, pero su mecanismo regulador detallado sigue sin estar claro. En nuestro estudio, la coexpresión de XYR1 y PT-ACE3 de tipo salvaje (cepa E1AB1-XwtAnhr) no mostró un aumento en la productividad de la celulasa en comparación con la expresión constitutiva de PT-ACE3 (cepa E1AB1-A3) (Fig. 3). Además, en una cepa industrial derivada de Rut-C30, la producción de celulasa no aumentó en ausencia de inductores de celulasa al reemplazar el promotor xyr1 nativo con promotores constitutivos, como promotores de fosfoglicerato quinasa, histona 3 y factor de transcripción de cremallera de leucina básica. genes12. Por el contrario, la sobreexpresión de XYR1 de tipo salvaje utilizando el promotor reprimible de cobre Ptcu1 en la cepa T. reesei QM9414 resultó en una producción alta de celulasa en cultivos enriquecidos con glucosa57. Aunque el promotor act1 se seleccionó como el promotor expresado constitutivamente en este estudio, podría haber sido insuficiente para mejorar el nivel de expresión de xyr1 de tipo salvaje, y posiblemente la celulasa podría inducirse mediante la sobreexpresión de XYR1 de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión de xyr1V821F mutado usando el mismo promotor act1 condujo a una notable producción de xilanasa en condiciones no inductoras (Fig. 1). También se sugiere que la modificación postraduccional de XYR1 puede ser necesaria para la activación completa de la transcripción del gen de celulasa y hemicelulasa12. Las mutaciones en el dominio de activación ácido de XYR1, como A824V o V821F, podrían imitar las modificaciones postraduccionales y activar al menos la expresión de xilanasa a niveles más bajos que el XYR1 de tipo salvaje. Por lo tanto, se sugirió que los perfiles de expresión de celulasa/hemicelulasa son diferentes incluso usando la misma fuerza de promotor en XYR1 de tipo salvaje y mutado, y se necesita más investigación para determinar si el nivel de expresión de XYR1V821F mutado fue óptimo en este estudio y el efecto de la fuerza del promotor para impulsar el XYR1 de tipo salvaje/mutado.

Se ha demostrado que otro factor de modificación, ACE3, desempeña un papel importante en la regulación de la celulasa, pero su análisis funcional sigue sin estar claro. ACE3 en T. reesei NG14 y las cepas RUT-C30 y RL-P37 derivadas tienen un truncamiento de 11 aminoácidos en el extremo C-terminal, lo que resulta en una mayor productividad de celulasa42. Además, Luo et al. informó una producción alta de celulasa incluso en condiciones sin inductores mediante la sobreexpresión de ACE3 con truncamiento C-terminal de 7–17 aminoácidos, utilizando la cepa RL-P37 como cepa original43. En este sistema informado, ninguno de los ace3 tenía un C-terminal43 de tipo salvaje completo. Por el contrario, en este estudio, en la cepa E1AB1 derivada de la cepa PC-3–7, ace3 en el genoma tenía un C-terminal completo, y ace3 con expresión mejorada adicional no tenía mutación C-terminal. Sin embargo, se logró una alta producción de celulasa en condiciones no inductoras mediante la coexpresión con XYR1V821F mutado (Fig. 3a). Luo et al. sugirió que los 17 aminoácidos C-terminales de ACE3 pueden ser el propio dominio represor o parte de un dominio que interactúa con el represor43. Nuestros resultados indicaron que la mutación C-terminal de ACE3 no es esencial para la producción de celulasa sin inductores y que su interacción con XYR1V821F mutado puede liberar directa o indirectamente su función inhibitoria en el C-terminal de ACE3.

Además, Luo et al. informaron que se requería un dominio de unión a ADN de tipo Zn(II)2Cys6 con las seis cisteínas en el extremo N-terminal y una mutación específica en el extremo C-terminal para la producción de celulasa libre de inductores43. Por el contrario, en el presente estudio, la expresión de FL-ACE3 con un dominio de unión a ADN N-terminal completo mejoró la productividad de la celulasa. Sin embargo, sorprendentemente, PT-ACE3 con un dominio de unión al ADN incompleto fue más productivo (Fig. 3). Se propuso que ACE3 formara homodímeros con ACE3 y heterodímeros con XYR141, y expresara constitutivamente PT-ACE3 que posiblemente interactúe con ACE3 nativo (que tiene un dominio de unión a ADN completo), PT-ACE3, XYR1 nativo o XYR1V821F mutado. Además, los niveles de transcripción de FL-ace3 no aumentaron significativamente en condiciones inducidas con celulosa, y las transcripciones que corresponden principalmente a PT-ace3 aumentaron (Fig. 3e, carril 1), lo que respalda los informes anteriores43. Por lo tanto, se requiere ACE3 con capacidad de unión al ADN para la expresión de celulasa, pero no necesariamente para aumentar el nivel de expresión. Se consideró que ACE3 correspondiente a PT-ACE3 regula la expresión de celulasa a través de la formación de dímeros e interacciones con otros factores también durante la producción de celulasa con inductores. El dominio de unión al ADN de ACE3 se clasifica como un grupo binuclear Zn(II)2Cys6 similar a Gal4; Se sabe que Gal4 se une al ADN como un homodímero58. Por lo tanto, se especuló que los homodímeros con PT-ACE3 (con PT-ACE3 o FL-ACE3 nativo), en los que se truncó una parte del dominio de unión al ADN, pierden la capacidad de unión al ADN. Sin embargo, los resultados de la coexpresión y las regiones de aumento de la transcripción durante la producción inducida en la Fig. 3e sugirieron que la presencia de PT-ACE3 regula positivamente la producción de celulasa. Por lo tanto, la unión al ADN de ACE3 también puede desempeñar un papel en la inhibición, según el estado. También se pensó que la heteromerización con XYR1, que puede unirse al ADN, podría activar la producción de celulasa, pero se necesitaría más investigación sobre la función de ACE3 con truncamiento parcial del dominio de unión al ADN.

Los loci ace125 y rce126 utilizados para insertar xyr1V821F y otros factores relacionados con la regulación de la celulasa eran represores conocidos. En este estudio, su interrupción no fue esencial y no contribuyó a mejorar la composición de la celulasa, aunque aumentó la concentración total de proteína secretada (Fig. 3b, c). La productividad enzimática de la cepa E1AB1-XA3 que usaba glucosa mejoró en comparación con las cepas E1AB1-X y E1AB1-A3, pero fue ligeramente inferior a la cepa original E1AB1 que usaba celulosa (Figs. 1a, 3c, 4c). Esto parecía depender en gran medida de la propiedad de la celulosa como fuente de carbono y su inducibilidad. La glucosa es extremadamente fácil de asimilar y se consume rápidamente; por lo tanto, se agotó después de 48 h en este estudio (archivo adicional Fig. S3). Por el contrario, la celulosa no se asimila fácilmente y se degrada lentamente, liberando celobiosa y glucosa durante mucho tiempo, y se considera menos probable que induzca la RCC. La cepa E1AB1 utilizada en este estudio es una cepa industrial que se ha sometido a reproducción de mutaciones repetidas, y la mutación cre150 y la interrupción de la α-tubulina (tubB)54 han eliminado varias regulaciones supresivas, incluida la CCR. Sin embargo, incluso en esta cepa, la producción de enzimas fue leve, mientras que las concentraciones de glucosa fueron altas (archivo adicional, Fig. S3). Luo et al.43 también mencionaron que la producción de (hemi)celulasa solo ocurre después de que la glucosa se ha agotado por debajo de un cierto umbral, y la CCR no se superó por completo. En el estado actual, las prácticas para evitar la CCR (por ejemplo, el cultivo por lotes59,60) son necesarias para lograr una alta productividad de celulasa equivalente a los cultivos que utilizan celulosa, y la expresión constitutiva de activadores como XYR1 y ACE3 por sí sola no puede superar la CCR. . Por lo tanto, se necesita más investigación de los mecanismos de represión además de la modificación de estos activadores.

Debido a su alta capacidad de producción, T. reesei es un huésped prometedor para la producción de proteínas heterólogas. Sin embargo, usar el sistema convencional de producción de enzimas a base de celulosa es difícil para la producción de proteínas heterólogas61,62. Si los genes de celulasa se reemplazan con genes para las proteínas de interés, entonces la celulosa no se puede descomponer y el inductor no se libera, lo que disminuye la capacidad de producción de proteínas. Por el contrario, si la celulasa no se altera, se contaminarán grandes cantidades de celulasas nativas62. Los informes anteriores mostraron la producción de proteínas heterólogas utilizando los promotores xyn1 y xyn2 con xyr1A824V63. Sin embargo, los resultados de este estudio indican que se ha vuelto posible utilizar promotores de celulasa extremadamente potentes, como cbh1 y cbh2, para la producción de proteínas heterólogas sin la coproducción de celulasa. Se espera que estos potentes promotores de celulasa sean herramientas de gran productividad que puedan utilizarse para expresar enzimas sacarificantes para la producción de bioetanol y varias proteínas valiosas.

Las cepas de T. reesei utilizadas en esta investigación se enumeran en la Tabla 1. Las cepas de T. reesei E1AB153 y E1AB1Δpyr4 (auxótrofo de uracilo) fueron proporcionadas amablemente por el Prof. W. Ogasawara (Universidad de Tecnología de Nagaoka). Las cepas se mantuvieron en placas de agar papa dextrosa (PDA; Difco Laboratories, Detroit, MI).

Para la producción de enzimas de precultivo, se inocularon 4 × 105 esporas de cada cepa en 2 ml de medio basal48 que contenía glucosa al 1 % (p/v) en un tubo de cultivo de 10 ml. Las esporas se contaron utilizando un hemocitómetro Thoma (Sunlead Glass Corp.). El medio basal comprendía 0,14 % (p/v) (NH4)2SO4, 0,2 % (p/v) KH2PO4, 0,03 % (p/v) CaCl2 · 2H2O, 0,03 % (p/v) MgSO4 7H2O, 0,1 % (p/v) /v) polipeptona, extracto de levadura al 0,05 % (p/v), Tween 80 al 0,1 % (p/v) y solución de elementos traza al 0,1 % (p/v) en tampón de tartrato de sodio 50 mM (pH 4,0). La solución de oligoelementos contenía 6 mg H3BO3, 26 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O, 100 mg FeCl3·6H2O, 40 mg CuSO4·5H2O, 8 mg MnCl2·4H2O y 200 mg ZnCl2 en 100 ml de agua destilada. El precultivo se realizó mediante agitación a 220 rpm, a 28 °C durante 2 días. Para cada uno de los cultivos principales, se inocularon 500 μL del precultivo en 50 mL de medio basal que contenía 3% (p/v) de celulosa en polvo (KC FLOCK W-400G, Nippon Paper Industries) o glucosa y 1,28% (p/v) ) citrato de hidrógeno diamónico en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. El cultivo principal se agitó a 220 rpm a 28 °C durante 3 a 5 días. Para el muestreo, las células se extrajeron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 16 000 g durante 5 min y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa de 0,20 μm (13CP020AN; Advantec, Toyo Roshi Kaisha). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Los genes de interés se amplificaron a partir del ADN genómico de la cepa PC-3–7 de T. reesei y se amplificó un fragmento del vector mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) inversa utilizando pUC118 (Takara Bio) como plantilla. Los fragmentos amplificados, diseñados con cebadores que añadían un sitio de escisión SwaI, se ligaron con un kit de clonación In-Fusion HD (Clontech) según el protocolo del fabricante. Se usó Escherichia coli DH5a como huésped de clonación y se usó un kit de minipreparación NucleoSpin® Plasmid (Takara Bio) para purificar el ADN del plásmido. Se proporcionan más detalles sobre el gen clonado y los cebadores en el archivo adicional, Tabla S5. El fragmento de vector pUC-K017 se generó por PCR inversa; se derivó del plásmido insertado con ace1 ligado (pUC-K003) y el casete marcador pyr4 (pUC-K016). Se ligó un fragmento de PCR inversa de la construcción de interrupción de ace1 (pUC-K017) y fragmentos del promotor act1, xyr1 y el terminador cbh1 para generar el plásmido ΔAce1-Pact1-xyr1-pyr4 (pUC-K019). Usando este plásmido como plantilla, se realizó una PCR inversa para mutar valina a fenilalanina en la posición 821 para obtener ΔAce1-Pact1-xyr1V821F-pyr4 (pUC-K020) y para mutar alanina a valina en la posición 824 para obtener ΔAce1-Pact1-xyr1A824V- pyr4 (pUC-K021). De la misma manera, un fragmento de PCR inversa del constructo de interrupción rce1 (pUC-K018) y fragmentos del promotor act1, ORF (crt1, bglr, vib1, ace2, PT-ace3, FL-ace3) y el terminador cbh1 fueron ligados para generar los plásmidos pUC-K022, pUC-K023, pUC-K024, pUC-K025, pUC-K026 y pUC-K027, respectivamente. Para PT-ace3 y FL-ace3, se usó pUC-K010 como plantilla para diseñar un cebador directo basado en los dos tipos de codones de iniciación putativos. En el archivo adicional, tabla S6, se proporcionan más detalles sobre la construcción de vectores y los cebadores utilizados.

Los plásmidos se linealizaron con SwaI antes de la transformación de T. reesei, o el producto de la PCR se transformó utilizando un método de protoplasto-PEG modificado64, en el que se usaron 20 mg/mL de Yatalase (Takara Bio) como enzima protoplastadora en lugar de Novozyme 234 (Novozymes Bagsværd, Dinamarca). Los protoplastos transformados se sembraron en medio de transformación mínimo [2,0 % (p/v) de glucosa, 18,27 % (p/v) de sorbitol, 0,5 % (p/v) de (NH4)2SO4, 0,2 % (p/v) de CaCl2, 0,06 % (p/v) de MgSO4, 0,21 % (p/v) de CsCl y solución de oligoelementos al 0,1 % (p/v) en tampón KH2PO4 100 mM (pH 5,5)] para el marcador pyr4. La solución de oligoelementos contenía 500 mg de FeSO4·7H2O, 200 mg de CoCl2, 160 mg de MnSO4·H2O y 140 mg de ZnSO4·7H2O en 100 ml de agua destilada. Después de dos semanas de incubación a 30 °C, los transformantes candidatos se sembraron dos veces en placas selectivas (cada medio de transformación mínimo sin sorbitol) durante varios días a 30 °C para el aislamiento de una sola colonia. A continuación, se transfirieron colonias individuales a placas PDA durante una semana a 30 °C para permitir la formación de conidios. De acuerdo con el protocolo del fabricante, se confirmó un transformante por PCR de colonia usando KOD One (Toyobo). Para transformar de nuevo los transformantes resultantes utilizando el medio PDA que contenía monohidrato de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) al 0,2 % (p/v), se seleccionó una cepa que volvió a adquirir resistencia a 5-FOA (emergencia de pyr4 mediante recombinación homóloga).

De acuerdo con el protocolo del fabricante, la concentración de proteínas se determinó usando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad) con gamma globulina bovina como estándar. La concentración de glucosa en el sobrenadante se cuantificó usando el kit Wako de prueba de glucosa CII (Wako Chemicals). En concreto, se añadieron 150 μL de la solución de reacción a 1 μL de los sobrenadantes diluidos en una placa de 96 pocillos, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. La absorbancia de todas las muestras y patrones se midió a 505 nm utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices).

El sedimento celular a las 48 h, recogido por centrifugación, se deshidrató ligeramente y se congeló en nitrógeno líquido. En la muestra congelada se colocó un cono metálico previo a la trituración con un Multi-Beads Shocker (Yasui Kikai Corp.) a 1700 rpm durante 10 s, y posteriormente se realizó la extracción de ARN con el RNeasy Mini Kit (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. protocolo. La digestión de gDNA y la síntesis de cDNA se realizaron utilizando ezDNase™ Enzyme (Invitrogen) y SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (Invitrogen), respectivamente. Los experimentos de RT-qPCR se realizaron con Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mixes (Agilent), y los niveles transcripcionales se evaluaron mediante el método ΔΔCt utilizando el gen pgk1 como normalizador y E1AB1 (Fig. 3d,e) o E1AB1-X (Fig. 4a) tensión como calibrador. Todas las muestras se analizaron en al menos tres experimentos biológicos independientes. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real se diseñaron con Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) y se enumeran en la Tabla S4 del archivo adicional.

SDS-PAGE se llevó a cabo usando Any kD Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels (Bio-Rad) durante 35 min a 200 V. El gel se activó durante 5 min y se tomaron imágenes con el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad). Se utilizó el estándar sin teñir de proteína Precision Plus (5 μL; Bio-Rad) como marcador de masa molecular. A menos que se indique lo contrario, se cargaron 2,5 μg de proteína en cada pocillo. Los geles se recortaron en el rango de 15 a 250 kDa porque no se detectaron bandas claras por debajo de 15 kDa (el gel original de las Figs. 1b, 2b y 3b se presentó en las Figs. S4, S5 y S6, consulte el archivo adicional). El peso molecular de las bandas de proteínas se estimó utilizando el software Image Lab (BiFio-Rad), y las bandas de proteínas se anotaron utilizando las posiciones correspondientes a las celulasas y xilanasas53 informadas previamente. La identificación de proteínas mediante sistemas nano LC-MS/MS se realizó en Japan Proteomics Co. LTD.

Las actividades enzimáticas de celobiohidrolasa, β-glucosidasa, xilanasa y β-xilosidasa se midieron utilizando los sustratos p-nitrofenil-β-d-lactosido (pNPL), p-nitrofenil-β-d-glucopiranósido (pNPG), p-nitrofenil -β-xilobiósido (pNPX2) y p-nitrofenil-β-d-xilopiranósido (pNPX), respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo en acetato de sodio 50 mM a pH 5,0 y 50 °C durante 10 min y se terminaron añadiendo un volumen de Na2CO3 1 M. El p-nitrofenol liberado se cuantificó midiendo la absorbancia a 420 nm. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de p-nitrofenol por minuto a 50 °C. La sacarificación de la celulosa se realizó en una escala de 1 ml en botellas de vidrio con tapón de rosca de 9 ml con una carga del 5 % (p/v) de celulosa microcristalina (Avicel® PH-101, Sigma-Aldrich) en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 5.0, utilizando una carga enzimática de 2,0 mg de proteína/g de celulosa. La concentración de proteína se determinó como se mencionó anteriormente. La reacción se realizó a 50 °C con agitación a 150 rpm durante 72 h. Las muestras obtenidas tras la sacarificación se filtraron (0,2 μm) y se midió la concentración de glucosa mediante un ensayo enzimático y un Multifunction Biosensor BF-7 (Oji Scientific Instruments), según el protocolo del fabricante.

Todos los experimentos se realizaron con al menos tres muestras independientes. Las barras de error indican la desviación estándar (SD) de la media de los triplicados. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas. Dentro de cada conjunto de experimentos, p < 0,05 se consideró significativo.

Las secuencias de proteínas y nucleótidos utilizadas en este estudio pueden consultarse en Uniprot con los siguientes ID de acceso: ACE1_G0RCC6, RCE1_G0RBV8, XYR1_G0RLE8, CRT1_G0RGH7, BGLR_G0RVU2, VIB1_G0R8Z5, ACE2_G0RKV9, ACE3 (parcialmente truncado)_G0RIA0, ACE3 (full l-longitud)_A0A5C1J077.

β-glucosidasa

β-xilosidasa

celobiohidrolasa

Represión del catabolito de carbono

endoglucanasa

Reacción en cadena de la polimerasa

p-nitrofenil-β-d-glucopiranósido

p-nitrofenil-β-d-lactosido

p-nitrofenil-β-d-xilopiranósido

p-nitrofenil-β-xilobiosido

Xilanasa

de Paula, RG et al. Selección de huéspedes microbianos diseñados para bioproductos de valor agregado a partir de lignocelulosa. Biotecnología. Adv. 37, 107347 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Cristina, A. et al. Ingeniería de holocelulasa en hongos degradadores de biomasa para la producción sostenible de biocombustibles. J. Limpio. Pinchar. 371, 133488 (2022).

Artículo Google Académico

Nevalainen, H. & Peterson, R. Elaboración de proteínas recombinantes en hongos filamentosos: ¿esperamos demasiado?. Frente. Microbiol. 5, 1–10 (2014).

Google Académico

Cherry, JR & Fidantsef, AL Evolución dirigida de enzimas industriales: una actualización. actual Opinión Biotecnología. 14, 438–443 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bischof, RH, Ramoni, J. & Seiboth, B. Celulasas y más allá: los primeros 70 años del productor de enzimas Trichoderma reesei. Microbio. Hecho celular. 15, 1–13 (2016).

Artículo Google Académico

Martínez, D. et al. Secuenciación y análisis del genoma del hongo degradador de biomasa Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina). Nat. Biotecnología. 26, 553–560 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gusakov, AV Alternativas a Trichoderma reesei en la producción de biocombustibles. Tendencias Biotecnología. 29, 419–425 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fonseca, LM, Parreiras, LS y Murakami, MT Ingeniería racional de la cepa Trichoderma reesei RUT-C30 en una plataforma industrialmente relevante para la producción de celulasa. Biotecnología. Biocombustibles 13, 1–15 (2020).

Artículo Google Académico

Johnson, E. La producción integrada de enzimas reduce el costo del etanol celulósico. Biocombustibles Bioprod. Biorrefinación 10, 164–174 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Klein-Marcuschamer, D., Oleskowicz-Popiel, P., Simmons, BA & Blanch, HW El desafío del costo de las enzimas en la producción de biocombustibles lignocelulósicos. Biotecnología. Bioing. 109, 1083–1087 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adsul, M. et al. Diseño de un cóctel de enzimas celulolíticas para la conversión eficiente y económica de biomasa lignocelulósica en biocombustibles. Microbio enzimático. Tecnología 133, 109442 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fischer, J., Schroeckh, V. & Brakhage, AA Despertar de grupos de genes de metabolitos secundarios fúngicos. en Sistemas de Expresión Génica en Hongos: Avances y Aplicaciones. Biología fúngica (Schmoll, M., Dattenböck, C. eds.). 253-273 (2016)

Kubicek, CP, Mikus, M., Schuster, A., Schmoll, M. y Seiboth, B. Estrategias de ingeniería metabólica para mejorar la producción de celulasa por Hypocrea jecorina. Biotecnología. Biocombustibles 2, 19 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Adnan, M., Ma, X., Olsson, S., Wang, J. & Liu, G. Regulación de promotores y estrategias de ingeniería genética para mejorar la expresión de celulasa en Trichoderma reesei. Microbiol. Res. 259, 127011 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shida, Y., Furukawa, T. & Ogasawara, W. Descifrando los mecanismos moleculares detrás de la producción de celulasa en trichoderma reesei, el hongo filamentoso hipercelulolítico. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 80, 1712-1729 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adnan, M. et al. Represión de catabolitos de carbono en hongos filamentosos. En t. J. Mol. ciencia 19, 1–23 (2018).

ANUNCIOS Google Académico

Ilmén, M., Thrane, C. & Penttilä, M. El represor de glucosa genecre1 de Trichoderma: Aislamiento y expresión de una forma mutante truncada y de longitud completa. mol. Gen. Genet. 251, 451–460 (1996).

Académico de Google de PubMed

Campos Antoniêto, AC et al. Represión de catabolitos de carbono mediada por Trichoderma reesei CRE1 en respuesta a la soforosa a través del análisis de secuenciación de ARN. actual Genómica 17, 119–131 (2015).

Han, L. et al. Rediseño del factor de transcripción Cre1 para aliviar la represión de catabolitos de carbono en Trichoderma reesei. sintetizador sist. Biotecnología. 5, 230–235 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Mandels, M. & Reese, ET Inducción de celulasa en hongos por celobiosa. J. Bacteriol. 79, 816–826 (1960).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mandels, M., Parrish, FW y Reese, ET Sophorose como inductor de celulasa en Trichoderma viride. J. Bacteriol. 83, 400–408 (1962).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sternberg, D. & Mandels, GR Inducción de enzimas celulolíticas en Trichoderma reesei por sophorose. J. Bacteriol. 139, 761–769 (1979).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morikawa , Y. , Ohashi , T. , Mantani , O. & Okada , H. Inducción de celulasa por lactosa en Trichoderma reesei PC-3-7. aplicación Microbiol. Biotecnología. 44, 106–111 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Cziferszky, A., Mach, RL & Kubicek, CP La fosforilación regula positivamente la unión al ADN del represor de catabolitos de carbono Cre1 de Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei). J. Biol. química 277, 14688–14694 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Aro, N., Ilmén, M., Saloheimo, A. & Penttilä, M. El ACEI de Trichoderma reesei es un represor de la expresión de celulasa y xilanasa. aplicación Reinar. Microbiol. 69, 56–65 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, Y. et al. Rce1, un nuevo represor transcripcional, regula la expresión del gen de la celulasa al antagonizar el transactivador Xyr1 en Trichoderma reesei. mol. Microbiol. 105, 65–83 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stricker, AR, Grosstessner-Hain, K., Würleitner, E. & Mach, RL Xyr1 (Xylanase Regulator 1) regula tanto el sistema de enzimas hidrolíticas como el metabolismo de la D-xilosa en Hypocrea jecorina. eucariota. Celda 5, 2128–2137 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mach-Aigner, AR et al. Regulación transcripcional de xyr1, que codifica el principal regulador del sistema enzimático xilanolítico y celulolítico en Hypocrea jecorina. aplicación Reinar. Microbiol. 74, 6554–6562 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lichius, A. et al. La secuenciación del genoma del mutante Trichoderma reesei QM9136 identifica un truncamiento del regulador transcripcional XYR1 como la causa de su fenotipo negativo de celulasa. BMC Genomics 16, 1–20 (2015).

CAS Google Académico

Zhang, X., Li, Y., Zhao, X. y Bai, F. Producción constitutiva de celulasa a partir de glucosa utilizando la cepa recombinante Trichoderma reesei que sobreexpresa un activador de transcripción artificial. Biorrecursos. Tecnología 223, 317–322 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Derntl, C., MacH, RL y MacH-Aigner, AR Factores de transcripción de fusión para una expresión fuerte y constitutiva de celulasas y xilanasas en Trichoderma reesei. Biotecnología. Biocombustibles 12, 1–18 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Derntl, C. et al. La mutación del regulador de xilanasa 1 provoca un fenotipo que expresa hidrolasa ciega a la glucosa en cepas de Trichoderma utilizadas industrialmente. Biotecnología. Biocombustibles 6, 1–11 (2013).

Artículo Google Académico

Ellila, S. et al. Desarrollo de un proceso de producción de celulasa de bajo costo utilizando Trichoderma reesei para biorrefinerías brasileñas. Biotecnología. Biocombustibles 10, 1–17 (2017).

Artículo Google Académico

Aro, N., Saloheimo, A., Ilmén, M. & Penttilä, M. ACEII, un nuevo activador transcripcional involucrado en la regulación de los genes de celulasa y xvlanasa de Trichoderma reesei. J. Biol. química 276, 24309–24314 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Häkkinen, M. et al. Detección de reguladores candidatos para la producción de celulasa y hemicelulasa en Trichoderma reesei e identificación de un factor esencial para la producción de celulasa. Biotecnología. Biocombustibles 7, 1–21 (2014).

Artículo Google Académico

Ivanova, C. et al. La secuenciación del genoma y el análisis del transcriptoma de la cepa Trichoderma reesei QM9978 revelan que una translocación cromosómica distal es responsable de la pérdida de la expresión de vib1 y la pérdida de la inducción de celulasa. Biotecnología. Biocombustibles 10, 1–15 (2017).

Artículo Google Académico

Ivanova, C., Bååth, JA, Seiboth, B. & Kubicek, CP El análisis de sistemas del metabolismo de la lactosa en Trichoderma reesei identifica una permeasa de lactosa que es esencial para la inducción de celulasa. PLoS ONE 8, 1–10 (2013).

Artículo Google Académico

Zhang, W. et al. Dos importantes transportadores de azúcar de la superfamilia facilitadora de Trichoderma reesei y sus funciones en la inducción de la biosíntesis de celulasa. J. Biol. química 288, 32861–32872 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nitta, M. et al. Un nuevo factor de transcripción de tipo Zn(II) 2Cys 6 BglR regula la expresión de β-glucosidasa en Trichoderma reesei. gineta fúngica. Biol. 49, 388–397 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stricker, AR, Trefflinger, P., Aro, N., Penttilä, M. & Mach, RL Papel de Ace2 (activador de celulasas 2) dentro del transcriptosoma xyn2 de Hypocrea jecorina. gineta fúngica. Biol. 45, 436–445 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, J. et al. El factor de transcripción ACE3 controla las actividades de la celulasa y el metabolismo de la lactosa a través de dos reguladores adicionales en el hongo Trichoderma reesei. J. Biol. química 294, 18435–18450 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, Y. et al. Ingeniería de Trichoderma reesei para mejorar la degradación de la biomasa lignocelulósica mediante el truncamiento del activador de celulasa ACE3. Biotecnología. Biocombustibles 13, 1–14 (2020).

Artículo Google Académico

Luo, Y. et al. La modificación del factor transcripcional ACE3 mejora la producción de proteínas en Trichoderma reesei en ausencia del inductor del gen de la celulasa. Biotecnología. Biocombustibles 13, 1–16 (2020).

Artículo Google Académico

Zhang, F., Zhao, X. y Bai, F. Mejora de la producción de celulasa en Trichoderma reesei Rut-C30 mediante la sobreexpresión de un nuevo gen regulador Trvib-1. Biorrecursos. Tecnología 247, 676–683 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, X., Song, B., Liu, M., Qin, L. y Dong, Z. Comprender el papel de Trichoderma reesei Vib1 en la expresión génica durante la degradación de la celulosa. J. Hongos 7, 613 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Havukainen, S., Valkonen, M., Koivuranta, K. & Landowski, CP Los estudios sobre el transportador de azúcar CRT1 revelan nuevas características que son críticas para la inducción de celulasa en Trichoderma reesei. Biotecnología. Biocombustibles 13, 1–20 (2020).

Artículo Google Académico

Wang, Z. et al. La caracterización funcional del transportador de azúcar CRT1 revela funciones diferenciales de su región C-terminal en el transporte de azúcar y la inducción de celulasa en Trichoderma reesei. Microbiol. espectro 10, 872 (2022).

Google Académico

Kawamori, M., Morikawa, Y. & Takasawa, S. Inducción y producción de celulasas por l-sorbosa en Trichoderma reesei. aplicación Microbiol. Rev. 24, 449–453 (1986).

CAS Google Académico

Shida, Y. et al. El impacto de una mutación de un solo nucleótido de bgl2 en la inducción de celulasa en un mutante de Trichoderma reesei. Biotecnología. Biocombustibles 8, 1–18 (2015).

Artículo Google Académico

De Oliveira Porciúncula, J. et al. Análisis de polimorfismo de un solo nucleótido de un mutante hipercelulolítico de Trichoderma reesei desarrollado en Japón. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 77, 534–543 (2013).

Artículo Google Académico

Schmoll, M. & Schuster, A. Biología y biotecnología de Trichoderma. aplicación Microbiol. Biotecnología. 87, 787–799 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Baba, Y., Sumitani, JI, Tani, S. & Kawaguchi, T. Caracterización de Aspergillus aculeatus β-glucosidasa 1 que acelera la hidrólisis de celulosa con el sistema de celulasa Trichoderma. Exp. AMB 5, 1–8 (2015).

CAS Google Académico

Nakazawa, H. et al. Una cepa de Trichoderma reesei de alto rendimiento que revela la importancia de la xilanasa III en la conversión de biomasa celulósica. Microbio enzimático. Tecnología 82, 89–95 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shibata, N. et al. La interrupción de la alfa-tubulina libera la represión del catabolito de carbono y mejora la producción de enzimas en Trichoderma reesei incluso en presencia de glucosa. Biotecnología. Biocombustibles 14, 1–16 (2021).

Artículo Google Académico

Zevenhuizen, LPTM & Bartnicki-Garcia, S. Estructura y función de un glucano citoplasmático soluble de Phytophthora cinnamomi. J. Gen. Microbiol. 61, 183–188 (1970).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, Y. et al. Trichoderma reesei ACE4, un nuevo activador transcripcional involucrado en la regulación de los genes de celulasa durante el crecimiento en celulosa. aplicación Reinar. Microbiol. 87, 1–16 (2021).

Artículo Google Académico

Zheng, F. et al. Ingeniería de Trichoderma reesei para hiperproducción de celulasas en glucosa para sacarificar eficientemente mazorcas de maíz pretratadas. J. Agric. Química alimentaria 68, 12671–12682 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hong, M. et al. Base estructural para la dimerización en el reconocimiento de ADN por Gal4. Estructura 16, 1019–1026 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watson, TG, Nelligan, I. & Lessing, L. Producción de celulasa por Trichoderma reesei (RUT-C30) en cultivo por lotes alimentados. Biotecnología. Letón. 6, 667–672 (1984).

Artículo CAS Google Académico

Jourdier, E. et al. Mapeo de la actividad de celulasa de Trichoderma reesei cultivado en mezclas de azúcar en condiciones de lote alimentado. Biotecnología. Biocombustibles 6, 1–12 (2013).

Artículo Google Académico

Nevalainen, H. & Peterson, R. Expresión heteróloga de proteínas en Trichoderma. en Desarrollos nuevos y futuros en biotecnología microbiana y bioingeniería: propiedades y aplicaciones del sistema Aspergillus. 89-102 (2016)

Rantasalo, A. et al. Nuevas herramientas genéticas que permiten la producción de proteínas de alta pureza en Trichoderma reesei. ciencia Rep. 9, 1–12 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, J., Wu, C., Wang, W., Wang, W. y Wei, D. Un sistema de expresión versátil de Trichoderma reesei para la producción de proteínas heterólogas. Biotecnología. Letón. 40, 965–972 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Penttilä, M., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E. & Knowles, J. Un sistema de transformación versátil para el hongo filamentoso celulolítico Trichoderma reesei. Gene 61, 155–164 (1987).

Artículo PubMed Google Académico

Descargar referencias

Los autores agradecen al Prof. Wataru Ogasawara de la Universidad Tecnológica de Nagaoka por proporcionar la cepa E1AB1 de T. reesei y al Prof. Ishii de la Universidad de Kobe por profundizar nuestra consideración discutiendo este estudio. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Investigación en ciencias biológicas, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, 640‑8580, Japón

Toshiharu Arai, Sakurako Ichinose, Nozomu Shibata, Hiroshi Kakeshita, Hiroshi Kodama, Kazuaki Igarashi y Yasushi Takimura

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

TA, SI y H.Ka. diseñó el estudio; TA analizó los resultados y redactó el manuscrito; SI participó en la construcción de cepas y análisis de genes; H. Ka. revisó el manuscrito; NS, H.Ka., H.Ko., KI y YT revisaron y comentaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Hiroshi Kakeshita.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Arai, T., Ichinose, S., Shibata, N. et al. Sistema de producción de celulasa libre de inductores basado en la expresión constitutiva de XYR1 y ACE3 mutados en el hongo industrial Trichoderma reesei. Informe científico 12, 19445 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

Descargar cita

Recibido: 23 Abril 2022

Aceptado: 07 noviembre 2022

Publicado: 14 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Fábricas de células microbianas (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.