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Jun 27, 2023

Síntesis del éster feniletílico del ácido salicílico (SAPE) y su implicación en funciones inmunomoduladoras y anticancerígenas

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 8735 (2022) Citar este artículo

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El éster feniletílico del ácido salicílico (SAPE) se sintetizó mediante la esterificación selectiva catalizada por Zn(OTf)2 del ácido salicílico y el alcohol feniletílico y se estudió su papel como agente inmunomodulador y anticancerígeno. Los estudios ADME-tox aclararon la baja toxicidad y las propiedades físicas, de tipo Lipinski y de solubilidad favorables. El acoplamiento molecular de SAPE contra COX-2 reveló una puntuación MolDockscore, una puntuación de reclasificación, una energía de interacción, una energía de pose interna y un enlace de hidrógeno favorables en comparación con el ibuprofeno y la indometacina. Se observó un RMSD promedio de ~ 0,13 nm para el complejo acoplado con una condición de equilibrio dinámico estable durante la simulación MD de 20 ns. Una brecha de banda baja que predice una fuerte afinidad de unión en el sitio activo de la enzima fue predicha además por el análisis DFT. El éster provocó una reducción en el porcentaje de hemólisis de eritrocitos y se demostró que no es citotóxico contra linfocitos humanos, CaCo-2 y células HepG-2 mediante el ensayo MTT. Además, se encontró que su eficacia in vitro en la inhibición de la enzima COX-2 bajo células intestinales estimuladas con LPS y ensayos de secuestro directo era mayor que la del ácido salicílico y la indometacina. La actividad anticancerígena de SAPE se probó en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y se mostró una eficacia potencial en términos de disminución de la viabilidad celular. El análisis de citometría de flujo mostró la detención del ciclo celular en las fases G1/G0 y S, durante las cuales se observó la inducción de la formación de vesículas autofágicas y la disminución del potencial de la membrana mitocondrial debido al aumento de la producción de ROS. Además, en estas fases también se observó el inicio de la apoptosis junto con el daño del ADN. El pretratamiento con SAPE en ratas Wistar inducidas por colitis mostró un bajo índice de actividad de la enfermedad y una reducción en el grado de alteración del tejido intestinal y peroxidación lipídica. Se observó un marcado aumento de las enzimas antioxidantes, a saber, catalasa, GGT y GST, y una disminución de las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α en los extractos de tejido intestinal de los grupos tratados. Los resultados de este estudio tienen suficiente credibilidad para respaldar que el éster sintetizado (SAPE) se considere un compuesto antioxidante y antiinflamatorio con potencial terapéutico para el tratamiento eficaz del cáncer.

Los ésteres fenólicos son parcialmente solubles en agua y exhiben propiedades antioxidantes y se encuentran abundantemente en productos naturales1. Poseen una variedad de actividades farmacológicas como efectos antiinflamatorios, antioxidantes, inmunomoduladores y anticancerígenos, por ejemplo, fenetiléster de ácido cafeico (CAPE), un componente fenólico activo del propóleo de abeja melífera2. Estos compuestos no son sofisticados estructuralmente; sin embargo, su síntesis suele ser complicada debido a la carga de grupos protectores para mejorar la quimioselectividad, o el uso de condiciones duras o el uso excesivo de uno de los reactivos3,4. Los rendimientos de esterificación están ligados a la distribución electrónica de los ácidos fenólicos que afectan la reactividad de la función carboxílica y también la longitud de la cadena carbonada de los alcoholes1. La esterificación de la función del ácido carboxílico mostró actividades antiinflamatorias más altas con un efecto ulcerogénico reducido en comparación con los compuestos estándar5. Además, la esterificación del ácido acetilsalicílico, ácido salicílico, ácido flufenámico, tolmetina y varios otros ácidos antiinflamatorios no esteroideos dan como resultado la producción de ésteres metílicos con menor actividad ulcerogénica gástrica6.

El ácido salicílico es un compuesto fenólico farmacológicamente activo y se encuentra en varias plantas. Su modo de acción incluye la inhibición de la síntesis de prostaglandinas y la supresión de la transcripción de genes para la ciclooxigenasa7. Se están reportando actividades anticancerígenas y enfermedades vasculares cerebrales del ácido salicílico8. El ácido acetilsalicílico, que es un derivado del ácido salicílico, es uno de los medicamentos antiinflamatorios más utilizados en el mundo e induce actividad anticancerígena57. Rigas y Kozoni10 sintetizaron un nuevo derivado feniléster de la aspirina y este compuesto inhibió el crecimiento de células de adenocarcinoma de colon humano (HT-29) a través de una combinación de efectos antiproliferativos y proapoptóticos. Çalışkan et al.11 también sintetizaron una serie de nuevos derivados del ácido 1-bencil-5(3)-p-tolil-1H-pirazol-3(5)-carboxílico y encontraron que algunos de estos compuestos exhibieron actividades analgésicas y antiinflamatorias. . Recientemente, Liu et al.12 sintetizaron un nuevo derivado mediante la reacción del ácido salicílico con α-aminofosfonato y demostraron que el derivado del ácido salicílico sintetizado tenía actividad inhibidora contra las líneas celulares de cáncer de hígado y de cuello uterino.

El ácido salicílico es muy sensible a la oxidación, ya que su hidroxilación por hidroxilasas microsomales hepáticas forma ácido gentísico, que puede reaccionar más para producir otros derivados hidroxilados por ataque de HO. Sin embargo, los derivados de salicilato oxidado poseen una mayor actividad antioxidante, en parte debido a su capacidad para funcionar como donantes de un solo electrón o átomo de hidrógeno13. Estos derivados fenólicos tienen una toxicidad aguda baja y el segundo grupo OH en posición orto o para aumenta la actividad antioxidante. Además, la actividad de los monofenoles aumenta considerablemente con uno o dos sustituyentes metoxilicos14. Los ésteres de ácido salicílico tienen un amplio espectro de actividades biológicas, y la esterficación del ácido salicílico con metanol se ha llevado a cabo utilizando diferentes catalizadores como resinas de intercambio catiónico modificadas con Ce4+15 y óxidos metálicos modificados con aniones como zirconia, alúmina y sílice16.

Nuestros estudios previos con cerveza de arroz (un producto fermentado tradicional de Assam, India), revelaron la presencia de una cantidad considerable de ácido salicílico en las plantas iniciales17 y 2-feniletanol (PEA) en el producto final18. La PEA es un alcohol aromático que se encuentra en los alimentos fermentados y varias cepas de levadura lo producen a partir de la L-fenilalanina a través de la vía de Ehrlich en la que intervienen tres enzimas19. Dado que no había informes disponibles sobre la esterificación del ácido salicílico con alcohol feniletílico utilizando trifluorometanosulfonato de zinc [Zn(OTf)2] como catalizador, por lo tanto, por primera vez se sintetizó éster feniletílico del ácido salicílico (SAPE) mediante catalización por Zn(OTf)2. esterificación selectiva. El éster sintetizado se probó más a fondo para determinar su función inmunomoduladora como agente antioxidante, antiinflamatorio y anticancerígeno a través de enfoques in silico, in vitro e in vivo.

La reacción para la producción de SAPE se ilustra en la Fig. SF1. La mezcla de acetato de etilo:hexano 40:60 produjo los mejores resultados en términos de concentración del compuesto. Los gráficos de RMN de 13C y RMN de 1H de la molécula de SAPE sintetizada se muestran en las Figs. SF2 y SF3, respectivamente. El gráfico FTIR de la molécula de SAPE sintetizada se muestra en la Fig. SF4. Los datos obtenidos son los siguientes: 13C (ppm): 3409, 65,8, 112,1, 118,1, 119,2, 126,12, 129,0, 130,1, 131,1, 135,2, 138,1, 161,8, 170,1. FTIR (cm−1): 501, 672, 750, 1070, 1110, 1220, 1292, 1480, 1683, 3150. 1H (ppm): 3,1 (t,2H), 4,52 (t,2H), 6,7–6,98 ( m,2H), 7,1–7,48 (m,5H), 7,7–7,8 (m,2H), 10,7 (s,1H).

Las propiedades de toxicidad de ADME están directamente relacionadas con el efecto biológico de los fármacos y su destino en un organismo, y los métodos in silico pueden predecir estas propiedades en una etapa temprana del diseño de fármacos20. La solubilidad, el volumen de distribución, la absorción, el transporte por la barrera hematoencefálica, la biodisponibilidad, los efectos sobre la salud y los valores de LD50 de la molécula SAPE según lo predicho por ACD/Labs I-Lab 2.0 se presentan en la Tabla ST1. Se encontró que la solubilidad (LogSw) era -4,03, mientras que la absorción (LogP) era 4,15, el transporte por la barrera hematoencefálica (LogP) era 4,15 y el volumen de distribución era 0,44 l/kg. La máxima absorción pasiva fue del 100% por vía transcelular, mientras que la permeabilidad en yeyuno humano fue de 7,51 × 10−4 cms−1. La probabilidad de que el compuesto tenga una biodisponibilidad de %F (oral) > 30% fue de 0,811 y la biodisponibilidad de %F (oral) > 70% fue de 0,358, mientras que la probabilidad de efecto en sangre fue de 0,39; sistema cardiovascular 0,5; sistema gastrointestinal 0.6, riñón 0.26, hígado 0.14 y pulmones fue 0.19. Se encontró que los valores de DL50 para ratas eran 570 mg/kg (administrados por vía intraperitoneal) y 2500 mg/kg (administrados por vía oral). La actividad CNS de SAPE también se muestra en la Fig. SF5. Las propiedades fisicoquímicas predichas de SAPE, a saber, la refractividad molar, el volumen molar, el paracor, el índice de refracción, la tensión superficial, la densidad y la polarizabilidad y las propiedades relacionadas con la espectrometría de masas de SAPE se muestran en la Tabla ST4. Además, también se dedujeron las propiedades de tipo Lipinski y se encontró que eran favorables (Tabla ST2).

Inicialmente, la predicción del sitio potencial de unión al ligando (sitio activo) en la COX-2 mostró que el volumen de la cavidad era de 56,32 Å3, la superficie de la cavidad de 175,36 Å2 y estaba posicionada en X: 13,44; Y: 24,14; Z: 24,58 con un radio del sitio de unión de 15 Å (Fig. SF6), y se realizó una simulación de acoplamiento molecular frente a SAPE, ibuprofeno e indometacina. La función de puntuación basada en cuadrícula, MolDock Score [GRID], se utilizó para evaluar las soluciones de acoplamiento. Dado que los compuestos bajo estudio poseían varios grados de libertad internos, se utilizó MolDock SE como un algoritmo de búsqueda alternativo21. Las poses superiores que se acoplaron en el sitio activo de COX-2 se muestran en la Fig. 1[i] A, B, C, D, E y F, y los valores se clasificaron según la puntuación de Rerank (Tabla 1).

[i] (A) Interacciones proteína-ligando entre SAPE y los residuos del sitio activo de la enzima COX-2 (B) Modo de unión de SAPE en los residuos del sitio activo de la enzima COX-2 (C) Interacciones proteína-ligando entre el ibuprofeno y el sitio activo residuos de la enzima COX-2 (D) Modo de unión del ibuprofeno en el sitio activo residuos de la enzima COX-2 (E) Interacciones proteína-ligando entre la indometacina y el sitio activo residuos de la enzima COX-2 (F) Modo de unión de la indometacina en el residuos del sitio activo de la enzima COX-2. [ii] Simulación MD que muestra el gráfico RMSD del complejo ligando de proteína acoplado que muestra que SAPE-COX-2 es más estable que el complejo de ibuprofeno e indometacina. [iii] (a) Orbital molecular que representa el HOMO (E = -6,29 eV) de SAPE calculado en el nivel de teoría DFT/B3LYP/6-31G. ( b ) Orbital molecular que representa el LUMO (E = -1.09 eV) de SAPE calculado en el nivel de teoría DFT / B3LYP / 6-31G.

Los puntajes de acoplamiento molecular (Tabla 1) revelaron que SAPE podría acoplarse en el sitio activo de la proteína COX-2 con puntajes de acoplamiento favorables; lo cual es una indicación de que la enzima generalmente favorece a SAPE en comparación con el ibuprofeno y la indometacina. En el motor de acoplamiento molecular, SAPE, ibuprofeno e indometacina se clasificaron como los cinco principales aciertos de acoplamiento en función de la puntuación de MolDock, la puntuación de Rerank y la energía de interacción. La puntuación MolDock empleada en la presente investigación se deriva de las funciones de puntuación PLP propuestas originalmente por Gehlhaar et al.22, y posteriormente ampliadas por Yang et al.23. La función de puntuación de acoplamiento, Escore, se define como: EScore = Einter + Eintra, donde Einter es la energía de interacción ligando-proteína y Eintra es la energía interna del ligando. Mientras que la puntuación Rerank es una combinación lineal de E-inter (estérico, Van der Waals, puente de hidrógeno y electrostático) entre el ligando y la proteína, y E-intra (torsión, sp2–sp2, puente de hidrógeno, Van der Waals y electrostático) del ligando ponderado por los coeficientes predefinidos.

Para examinar la interacción molecular, se evaluó el análisis de interacción ligando-proteína para los aciertos de acoplamiento SAPE, ibuprofeno e indometacina utilizando el MVD Ligand Energy Inspector, y la Tabla 2 muestra los detalles de las interacciones moleculares de los aciertos de acoplamiento. Se determinó la interacción ligando-proteína incluyendo la interacción residuo y sus distancias de interacción, por lo que SAPE mostró interacción molecular con Leu353(O) y Tyr356(OH) (Fig. 1A y B), ibuprofeno con Arg121(NH2) y Tyr356(OH) (Fig. 1C y D) mientras que indometacina con Arg514(NH) e His90(NE) (Fig. 1E y F). El mapa de energía y la interacción electrostática de los golpes de acoplamiento se muestran en las Figs. SF7A y B, SF8A y B y Fig. SF9A y B. El mapa de energía de la enzima que contribuye a la interacción estérica favorable (color verde), aceptor de hidrógeno favorable (color turquesa) y donante de hidrógeno favorable (color amarillo) e interacción electrostática de los compuestos acoplados también apoyan la interacción molecular favorable.

La simulación MD se llevó a cabo solo para el golpe de acoplamiento (complejos acoplados SAPE-COX-2, ibuprofeno-COX-2 e indometacina-COX-2). Los datos de RMSD para los complejos acoplados a ligandos de proteína se trazaron y presentaron en la Fig. 1[ii]. Se elaboró ​​la columna vertebral de RMSD de simulaciones MD de 20 ns para comprender los cambios conformacionales del complejo de unión proteína-ligando y la proteína que se produce en el entorno dinámico. El gráfico RMSD explica claramente las variaciones de la proteína COX-2 y los complejos de unión proteína-ligando. El RMSD promedio mostró ~ 0,13 nm para el complejo acoplado SAPE-COX-2. Mientras que la proteína mostró una desviación promedio de RMSD de ~ 0,23 nm, lo que revela una condición de equilibrio dinámico más estable del complejo proteína-ligando. Esto confirma la estabilidad conformacional del complejo acoplado y simulado durante la ejecución de la simulación de 20 ns.

Las energías HOMO y LUMO de SAPE se ilustran en la Fig. 1[iii] A y B, respectivamente. Estas energías ayudan a comprender la energía de banda prohibida de la pose acoplada. Una brecha de energía de banda baja indica una mayor reactividad y, por lo tanto, se cree que el compuesto es lo suficientemente fuerte como para unirse al sitio activo de la proteína. La energía de la brecha de banda (ΔELUMO−HOMO) fue de -5,12 eV, lo que confirma una brecha de banda baja y definitivamente tendrá una fuerte afinidad de unión en el sitio activo de la enzima objetivo. El mapa de contorno para representar el potencial electrostático de SAPE y el espectro IR predicho de SAPE también se calcularon en el nivel de teoría DFT / B3LYP / 6-31G y estos se representan en la figura complementaria SF10 y SF11, respectivamente.

Los resultados del ensayo de estabilidad de la membrana en términos de porcentaje de hemólisis se muestran en la Fig. 2A. Se encontró que era del 0,0704 % en el caso del control negativo PBS y del 100 % en el caso del control positivo Triton X-100. Mientras que, en el caso de SAPE, se encontró que era del 58,08 % para 25 µg/mL, y difería significativamente en P ≤ 0,01 con el control positivo; y 56,28% y 54,88% para 50 µg/mL y 100 µg/mL, respectivamente, también difirieron significativamente (P ≤ 0,001) con el control positivo. Así, se observó que hasta 200 ug/mL, la funcionalización superficial de SAPE confería estabilidad a los glóbulos rojos y evitaba en gran medida la hemólisis. También se observó que la estabilidad de la membrana aumentaba con el aumento de la concentración de SAPE. Triton X-100 se usa generalmente para lisar células o para permeabilizar las membranas de las células vivas. Se observó que en presencia de SAPE, Triton X-100 exhibió una hemólisis significativamente menor que las muestras prístinas.

(A) Ensayo de estabilidad de membrana de SAPE en eritrocitos y (B), (C) y (D) Resultados del ensayo de viabilidad celular de SAPE a las 48 h en células de (A) PBMC, (B) Caco2 y (C) células HepG2 con dosis de (25, 50 y 100 µg/ml) o con DMSO al 0,1% como control del vehículo medido por el método basado en MTT. Los gráficos se presentaron en términos de porcentaje medio ± SEM de células muertas vivas de los tres conjuntos independientes. Los datos representados como media ± SEM Los valores fueron significativos en ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 y *P ≤ 0,05 en comparación con el control.

Los resultados del ensayo MTT de SAPE en PBMC, líneas celulares intestinales humanas derivadas de carcinoma de colon (CaCo-2) y líneas celulares de cáncer de hígado (HepG-2) se muestran en la Fig. 2B-D respectivamente. Mientras que no se observaron diferencias significativas (P ≤ 0,05) en la viabilidad celular en el caso de las PBMC, los resultados del ensayo con células CaCo-2 revelaron que el porcentaje de células viables aumentó con el aumento de la concentración de SAPE. No hubo ningún cambio significativo en el número de células viables después de tratar con 25, 50 y 100 µg/mL de SAPE, en comparación con el control. Sin embargo, a 200 µg/mL de SAPE se observó una diferencia significativa (P ≤ 0,05). Dado que las células CaCo-2 expresan varias características morfológicas y funcionales de los enterocitos absorbentes maduros con capa de borde en cepillo que se encuentran en el intestino delgado24,25, y los resultados corroboran la seguridad de la captación celular de SAPE. HepG-2 expresa la mayoría de las enzimas metabolizadoras de fármacos26, y en el ensayo con HepG-2 se observó que, aunque el porcentaje de células viables disminuyó con el aumento de las concentraciones de SAPE, no hubo un cambio significativo (P ≤ 0,05) en la número de células viables después del tratamiento con concentraciones variables de SAPE, en comparación con el control.

COX-2 es una isoforma inducible de la ciclooxigenasa que se produce principalmente en los tejidos inflamados y está ausente en los tejidos sanos. Es inducida en células migratorias y otras células por agentes proinflamatorios como endotoxinas, mitógenos y citocinas en condiciones patológicas 27. Muchos efectos antiinflamatorios, antipiréticos, analgésicos y antitrombóticos se atribuyen a la inhibición de la actividad de la COX-2 por los AINE. En el ensayo celular CaCo-2 estimulado con LPS, el porcentaje de inhibición de la producción de COX-2 se calculó considerando las células estimuladas no tratadas como control y los resultados se muestran en la Fig. 3A. Se observó que el alcohol feniletílico solo no poseía ninguna actividad inhibidora de la COX-2. El éster mostró una mejor inhibición de la COX-2 en todas las concentraciones estudiadas (25, 50 y 100 µg/ml) que el ácido salicílico. Además, a estas concentraciones, su actividad inhibidora de COX-2 estaba a la par con la indometacina. En el ensayo de inhibición directa también se observó que la actividad de SAPE era mayor (Fig. 3B). A una concentración de 100 µg/ml, el porcentaje de inhibición relativa (79,42%) que obtuvo SAPE fue superior tanto al ácido salicílico (68,13%) como a la indometacina (65,69%). Además, el bajo valor IC50 de SAPE (9,37 µg/ml) en comparación con el ácido salicílico (58,84 µg/ml) y la indometacina (12,69 µg/ml) es un claro indicativo de la eficacia de dosis altas del éster en condiciones in vitro.

(A) La inhibición de la producción de COX-2 en células CaCo-2 inflamadas, y (B) la inhibición relativa directa de COX-2 por alcohol fenil etílico (PEA), ácido salicílico (SA), éster fenil etílico de ácido salicílico (SAPE ) e indometacina (IM).

De los resultados se hace evidente que la esterficación del ácido salicílico aumenta considerablemente la actividad antiinflamatoria del ácido salicílico y estos resultados corroboran con los hallazgos anteriores5,13,14. Los hallazgos son enormes porque los compuestos que inhiben la actividad de la COX-2 tienen importancia tanto en el tratamiento de las respuestas inflamatorias como en el mantenimiento de la salud y el bienestar humanos. Esto se debe a que la expresión aberrante de COX-2 se ha implicado ampliamente en la patogenia de muchos tipos de cáncer, como el cáncer colorrectal, y sus altos niveles se han asociado con una tasa reducida de supervivencia de los pacientes con cáncer28.

Para determinar el efecto citotóxico de SAPE en las células MCF-7, se realizó un ensayo de viabilidad celular utilizando los métodos MTT (Fig. 4a) y exclusión del colorante azul tripán (Fig. 4b). Se evaluó el efecto de las células tratadas con varias dosis (25, 50 y 100 µg/mL) de SAPE sobre el número de células vivas y muertas, que se calcularon al final de las 48 h. Se observó que la disminución del número total de células se acompaña de un aumento significativo de la muerte celular. Los resultados demostraron claramente que SAPE podría inhibir significativamente el crecimiento exponencial de la viabilidad de las células MCF-7 con una concentración creciente, mientras que al mismo tiempo no tuvo ningún efecto pronunciado en las células normales, como se evidencia en el estudio con PBMC humanas, células Caco2 y HepG2. , lo que sugiere que el efecto de SAPE fue selectivo para las células cancerosas.

( a ) Resultados del ensayo de viabilidad celular de SAPE en células MCF-7 medidos mediante el método basado en MTT. (b) Ensayo de viabilidad celular de SAPE a las 48 h en células de MCF-7 con dosis de (25, 50 y 100 µg/mL) o con DMSO al 0,1 % como control del vehículo utilizando el método de exclusión con azul de tripano. Los gráficos se presentan en términos de porcentaje medio ± SEM de células vivas y muertas de los tres conjuntos independientes. Los valores fueron significativos en *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 y ***P ≤ 0,001 en comparación con el control.

La línea celular MCF-7 es un carcinoma de mama humano de subtipo luminal y ER positivo29. Se vio que el tratamiento de células MCF-7 con SAPE tiene una tendencia a la alteración en la distribución de varias fases del ciclo celular. Como es evidente en la Fig. 5A, el tratamiento con SAPE condujo a una disminución en el porcentaje de células en la fase G0/G1 y S, en comparación con las células no tratadas. Esto indica que SAPE da como resultado la inducción de la apoptosis, ya que las células sub-G1 son en realidad las células apoptóticas con bajo contenido de ADN. Tanto en la fase G2/M como en la apoptópica se ha visto que el tratamiento con SAPE provoca un aumento significativo del % de células. Por lo tanto, SAPE induce una detención prominente de G2/M en células MCF-7 en una naturaleza dependiente de la dosis (P ≤ 0,001). Sin embargo, cuando se aumentó la dosis de SAPE hasta 100 µg/mL, encontramos una disminución significativa en el porcentaje de células en la fase G1, sin embargo, también se detuvieron más células en la fase S y en la fase apoptótica ( Fig. 5A) del ciclo celular. Estos resultados sugieren que la inhibición del crecimiento celular conduce a un aumento en el número de células que entran en la fase G1, lo que posteriormente induce la apoptosis celular.

(A) Análisis del ciclo celular de SAPE en células MCF-7 con dosis de 25, 50, 100 μg/mL o con DMSO al 0,1 % como control del vehículo durante 48 h de distribución de fase del ciclo celular detectada en un citómetro de flujo. Visualización del histograma del contenido de ADN, a saber. PI-fluorescencia (eje x) frente a recuentos (eje y) y el diagrama de barras correspondiente es la representación de la distribución de fases del ciclo celular de las fases G0/G1, S y G2/M. (B) El efecto de SAPE sobre los niveles intracelulares de ROS en células MCF-7 a las 48 h se analizó mediante citómetro de flujo con colorante de fluorescencia específico de ROS (DCFDA). Los niveles intracelulares de ROS se representaron a través de un histograma y los cambios de pliegue correspondientes representados por un gráfico de barras se evaluaron mediante citometría de flujo. (C) Efecto de SAPE sobre MMP en células MCF-7. Después de eso, la intensidad fluorescente de rodamina-123 se midió mediante citometría de flujo a 488 nm (excitación) y 525–530 nm (emisión) y los datos se representaron a través de un histograma y los cambios de pliegue correspondientes representados por un gráfico de barras. Los datos representados como media ± SEM Los valores fueron significativos en ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 y *P ≤ 0,05 en comparación con el control.

Se analizó el nivel de ROS en las células para abordar el papel que desempeñan las ROS en la apoptosis inducida por SAPE. Se observó que al final de las 48 h de exposición a SAPE, la generación de ROS se indujo de manera significativa, como lo demuestra el aumento en la intensidad de la fluorescencia (Fig. 5B). En comparación con las células no tratadas, encontramos que SAPE provocó un aumento en el número de células positivas para ROS, así como una intensidad de fluorescencia media (MFI) de 1,30 veces (P ≤ 0,001) para MCF-7, como se muestra en la Fig. 5B. Las ROS se producen principalmente en las mitocondrias y una gradación ascendente en el nivel de ROS podría desencadenar eventos iniciados en las mitocondrias que conducen a la apoptosis. Además, la producción de ROS podría alterar la homeostasis del sistema enzimático de antioxidantes responsables de la eliminación de ROS. Las evidencias sugieren que la acumulación de ROS podría ser el resultado de un aumento en la proporción de Bax y Bcl-2, lo que disminuye la MMP (como será evidente en la sección "Análisis de MMP") e induce aún más la liberación de citocromo C58. Los resultados demuestran claramente que SAPE podría elevar significativamente el nivel de ROS en células MCF-7 y es un indicativo de la posible función de ROS en el proceso de apoptosis.

Se analizó la pérdida de MMP, ya que una pérdida de Δψm está directamente asociada con la alteración del equilibrio entre las expresiones de proteínas pro y antiapoptóticas dentro de la familia Bcl-2. Una reducción en Δψm conduce a la liberación de citocromo C mitocondrial, lo que da como resultado la formación de apoptosomas, lo que finalmente da como resultado la apoptosis mediada por mitocondrias30. La pérdida de ΔΨm se reflejó en una disminución de la intensidad de la técnica de tinción fluorescente con rodamina-123, que se utilizó para detectar la integridad de la membrana mitocondrial o la despolarización de la membrana mitocondrial. Los resultados de la presente investigación revelaron que con la exposición a SAPE, hubo una disminución significativa en el potencial de la membrana mitocondrial en comparación con el control. Esto se evidenció a partir del cambio en la intensidad de fluorescencia media (MFI) que mostró un aumento del cambio de veces a 1,34 veces (P ≤ 0,001) con las dosis más altas de SAPE a las 48 h (Fig. 5C). Estos resultados han demostrado claramente que SAPE podría inducir la apoptosis a través de vías mitocondriales, y esto podría ser una nueva estrategia para la terapia del cáncer, ya que las mitocondrias son una de las principales vías de apoptosis.

La apoptosis o muerte celular programada tipo I es un mecanismo incorporado en el cuerpo para destruir células que representan una amenaza para la integridad fisiológica de un organismo. Se activa por el desequilibrio entre las señales proapoptóticas y antiapoptóticas31. El principal cambio morfológico que caracteriza la apoptosis es la formación de cuerpos apoptóticos, junto con la formación de vesículas en la membrana, el encogimiento celular y la condensación de la cromatina30. Los resultados (Fig. 6A) mostraron que las células MCF-7 tratadas con SAPE en varias dosis exhibieron un gradiente de cambio de color de verde-naranja-rojo cuando se tiñeron con tinción dual AO/EtBr, lo que significa el efecto de la concentración efectiva a la que se expusieron las células. con, mientras que las células cancerosas no tratadas continuaron mostrando un color verde fluorescente. Por lo tanto, podría interpretarse que el aumento de la concentración (25 y 100 g/mL) de SAPE significativamente (P ≤ 0.001) indujo daño a las células cancerosas promoviendo la apoptosis de las células. Este daño nuclear varía desde la apoptosis temprana (que se encuentra en dosis bajas) hasta la apoptosis tardía o necrosis a medida que aumenta la dosis (Fig. 6A). Por lo tanto, la inducción de apoptosis en las células MCF-7 que las hace más susceptibles a la fagocitosis del huésped sin iniciar la inflamación podría atribuirse a la actividad tumoricida de SAPE.

(A) Imágenes representativas del ensayo de apoptosis de SAPE en MCF-7 con diferentes dosis (25 y 100 μg/mL) o con DMSO al 0,1 % como control del vehículo durante 48 h, determinado por tinción con colorante AO/EtBr; (B) Imágenes representativas de cometas para daños en el ADN de SAPE en células MCF-7 detectadas mediante un ensayo de cometa neutral y cuantificación del porcentaje de células dañadas en el ADN midiendo el (i) área del cometa y (ii) la longitud de la cola del cometa con Abra el software Comet. Datos representados como media ± SEM. Los valores fueron significativos en *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 y ***P ≤ 0,001 en comparación con el control.

El acceso a la integridad del ADN es un marcador útil para la detección de posibles agentes anticancerígenos, ya que las células expresan el fenómeno de la apoptosis después de sufrir daños en el ADN31. Además, la inducción de daño en el ADN podría ser una herramienta eficaz para el tratamiento del cáncer. Los resultados del ensayo de cometa neutral presentado en la Fig. 6B mostraron que el daño en el ADN en células MCF-7 expuestas a tres concentraciones diferentes de 25 y 100 µg/mL de SAPE durante 48 h se encontró significativamente (P ≤ 0.001) genotóxico para las células respectivas, como observado por el aumento dependiente de la concentración en la fragmentación del ADN. El ensayo del cometa es indicativo del nivel de daño del ADN heterogéneo dentro de las células individuales, y el daño del ADN en las células MCF-7 demuestra además un posible factor de respuesta tumoral para el compuesto32. Con base en estas observaciones, encontramos que SAPE podría inducir la apoptosis de las células MCF-7. Los agentes anticancerígenos que podrían modular la apoptosis pueden afectar el estado estacionario de las poblaciones celulares, lo que es eficaz para el tratamiento y la terapia del cáncer. Por lo tanto, podría especularse que SAPE tiene actividad anticancerígena contra las células MCF-7 a través de la inducción de la apoptosis.

La autofagia o muerte celular programada de tipo II es un mecanismo catabólico de muerte celular conservado evolutivamente que implica la degradación de proteínas u orgánulos dañados. Ejerce un papel protector que permite que las células cancerosas sobrevivan frente a los agentes citotóxicos. Durante la autofagia, los autofagosomas secuestran componentes citoplásmicos y posteriormente se fusionan con los lisosomas para formar autolisosomas, dentro de los cuales se degradan los orgánulos engullidos29,30. Para determinar si la inhibición de la autofagia mejoraba la apoptosis inducida por SAPE en células MCF-7, se llevó a cabo el análisis de autofagia. Se observó que la exposición de SAPE a las células MCF-7 provoca un aumento significativo tanto en el cuerpo autofágico como en las vesículas ácidas. También visualizamos el efecto del tratamiento con SAPE en la formación de orgánulos vesiculares ácidos (AVO) en células MCF-7 durante 48 h usando microscopía de fluorescencia tras la tinción con el agente lisosomotrópico AO como se muestra en la Fig. 7A. Como es evidente, el tratamiento de células MCF7 con SAPE dio como resultado la formación de vacuolas y mitocondrias condensadas, cromatina dispersa, formación de cuerpos apoptóticos, vesículas autofágicas y ampollas en la membrana. Las imágenes obtenidas por estudios de fluorescencia se procesaron con ImageJ para evaluar el grado de acidez y el número de autofagosomas. Mientras que las células no tratadas tenían una morfología nuclear y citoplásmica normal, se observó que hubo un aumento significativo en el grado de acidez de las células a concentraciones más altas (Fig. 7B). Además, también se encontró que la cantidad de autofagosomas aumenta con el tratamiento, lo que podría deberse al aumento en el grado de acidez, y esto refleja aún más el microambiente autofágico dentro de las células.

(A) Microscopía de fluorescencia para análisis de vesículas ácidas y autofagosomas frente a células MCF-7 tratadas con SAPE (B) Análisis del grado de acidez frente a células MCF7 tratadas con SAPE (25, 50, 100 µg/mL) durante 48 h. (C) Análisis de formación de vesículas autofágicas frente a células MCF7 tratadas con SAPE (25, 50, 100 µg/mL) durante 48 h; (D) La intensidad fluorescente media de AO medida mediante citometría de flujo a 488 nm (excitación) y 525–530 nm (emisión). Datos expresados ​​como (Media ± SEM, n = 3). Los valores fueron significativos en *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 y ***P ≤ 0,001 en comparación con el control.

Para el análisis cuantitativo, cuantificamos la fluorescencia de AO mediante citometría de flujo. La formación de vacuolas autofágicas se evidenció por una mayor intensidad de fluorescencia roja (Fig. 7C). Se observó que al final de las 48 h de exposición por tratamiento con SAPE, se indujeron significativamente vacuolas autofágicas, como lo indica el aumento en la intensidad de la fluorescencia (Fig. 7D). En comparación con las células no tratadas, encontramos que las células tratadas con SAPE con un rango de dosis de 25-100 µg/mL causaron un aumento de MFi de vacuolas autofágicas (1,48 veces a 50 µg/mL) en células positivas pero a 100 µg/mL disminuyó MFi a 0,613 pliegues como para 48 h. Como se desprende de otros estudios29,30, la autofagia desempeña un papel en la regulación de las respuestas de supervivencia en las células de melanoma maligno que han sido objeto de diferentes enfoques inmunoterapéuticos y, por lo tanto, estos resultados evidencian un papel positivo de SAPE como agente anticancerígeno contra las células MCF-7.

Los resultados obtenidos para la prueba del proceso inflamatorio agudo por modelo de edema de la pata se presentan en la Tabla 3. Se observó una disminución en el % de edema de la pata en el grupo tratado con SAPE desde la 1ª hora hasta la 5ª hora. Sin embargo, se observó una diferencia significativa solo en la 3ª, 4ª y 5ª hora después de la inyección de carragenina. Esta diferencia después de la 3ª hora podría ser indicativa de la acción de SAPE que implica la inhibición de la síntesis o la liberación de prostaglandinas. La ausencia de diferencias significativas en las primeras horas podría deberse a la falta de influencia de SAPE sobre los mediadores tempranos, a saber, histamina, serotonina o bradicinina. Inicialmente, durante la primera hora después de la inyección de carragenina, se liberan estos primeros mediadores, seguidos de la liberación de prostaglandinas alrededor de la 3.ª hora. Por lo tanto, los resultados son indicativos de que SAPE podría actuar como inhibidor de las enzimas ciclooxigenasas involucradas en la síntesis de prostaglandinas33.

Los pesos iniciales de las ratas se muestran en la Tabla ST3. La pérdida de peso en animales puede ocurrir después del tratamiento con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos. Esta pérdida de peso puede deberse principalmente a la caquexia, cuya principal causa puede deberse al exceso de citoquinas34. Sin embargo, como se ve en la Fig. SF12, se observó un aumento constante en el porcentaje de peso corporal con el tiempo en los tres grupos. Sin embargo, el aumento fue mayor en el grupo de control en comparación con los grupos tratados con SAPE y con indometacina. Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) se marcan mediante el índice de actividad de la enfermedad (DAI) que ayuda a evaluar la actividad de la enfermedad en un momento dado35. Los criterios de puntuación DAI y las puntuaciones DAI de los diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en las Tablas ST4 y Tabla ST5, respectivamente. Se observó que el grupo con colitis inducida sin ningún tratamiento (RG-CI) marcó la mayor puntuación de DAI con 2,42, mientras que en el grupo control fue de 0. Tanto el grupo tratado con SAPE (1,04 DAI) como el de indometacina (0,92 DAI) registraron puntuaciones más bajas que el grupo RG-CI. Por lo tanto, hubo una marcada diferencia en el grado de enfermedad inducida después de que los modelos de rata se sometieran a un pretratamiento con SAPE.

Los intestinos extirpados de los diferentes grupos de ratas después del tratamiento y la eutanasia, y sus imágenes SEM se muestran en la Fig. 8. Se observó cierto grado de daño tisular y ruptura en los grupos inducidos por colitis (RG-CI, RG-SP y RG-IM). ), que no se observó en el grupo control. En comparación con el grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento, las imágenes SEM para los grupos tratados con SAPE e indometacina mostraron una reducción distintiva en el nivel de daño tisular. Esto indica claramente una marcada reducción en la extensión de la colitis después del tratamiento con SAPE.

Intestinos extirpados e imágenes SEM de la sección intestinal de (A) RG-CF (grupo de control libre de colitis sin ningún tratamiento) ratas, (B) RG-CI (grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento) ratas, (C) RG-SP ( grupo inducido por colitis tratado con SAPE) ratas, ratas RG-IM (grupo inducido por colitis tratado con indometacina).

El daño oxidativo inducido por la inflamación se ve agravado por la disminución de las actividades de las enzimas antioxidantes, como la catalasa (CAT), la glutatión S-transferasa (GST) y la gamma-glutamiltransferasa (GGT), que actúan como captadores de radicales libres en condiciones asociadas con el estrés oxidativo36. Los ácidos grasos poliinsaturados, los glicolípidos, los fosfolípidos y el colesterol son objetivos bien conocidos de la modificación peroxidativa37 y los objetivos más comunes son los componentes de las membranas biológicas38. La peroxidación lipídica produce una amplia variedad de productos secundarios de oxidación, como los aldehídos, entre los cuales el malondialdehído (MDA) es el más mutagénico37. El MDA es un aldehído de bajo peso molecular que se genera como producto final mediante la descomposición del ácido araquidónico y PUFA más grandes, a través de procesos enzimáticos o no enzimáticos. La producción excesiva de MDA se ha asociado con diferentes estados patológicos y los sujetos afectados por varias enfermedades tienen niveles elevados de MDA. Por lo tanto, se utiliza como biomarcador conveniente para la peroxidación lipídica por su fácil reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA)37,38. Los resultados del ensayo del contenido de MDA en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se ilustran en la Fig. 9a. Se vio que hubo diferencia significativa (P ≤ 0.05) en el contenido de MDA entre todos los grupos. El grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento mostró el mayor contenido (0,26 pg/µl), mientras que el contenido fue menor en el grupo tratado con SAPE (0,10 pg/µl) en comparación con el grupo tratado con indometacina (0,16 pg/µl). Por lo tanto, SAPE podría considerarse como un potente inhibidor de la peroxidación lipídica en tejidos inflamados. CAT se considera un biomarcador sensible del estrés oxidativo en las células, ya que es un componente primario de defensa antioxidante para proteger las células del estrés oxidativo al eliminar el peróxido de hidrógeno tóxico del entorno intracelular y extracelular36,39. Los resultados del ensayo para la concentración de catalasa (CAT) en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en la Fig. 9b. Se vio que hubo diferencia significativa (P ≤ 0.05) en el contenido de CAT entre todos los grupos. El grupo de colitis inducida sin ningún tratamiento mostró el contenido más bajo (35,25 mU/mL), mientras que el grupo control registró el contenido más alto (201,25 mU/mL). El contenido fue nuevamente mayor en el grupo tratado con SAPE (168,75 mU/mL) en comparación con el grupo tratado con indometacina (152,00 mU/mL), lo que indica un papel positivo de SAPE en la síntesis y actividad de la enzima antioxidante CAT.

(a) Contenido de malondialdehído (MDA); (b) contenido de catalasa (CAT); (c) actividad de γ-glutamil transferasa (GGT); (d) actividad de glutatión S-transferasa (GST); (e) contenido de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y (f) contenido de interleucina 6 (IL-6) en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas (RG-CI: grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento; RG- CF: grupo control libre de colitis sin ningún tratamiento; RG-SP: grupo inducido por colitis tratado con SAPE; Grupo RG-IM: grupo inducido por colitis tratado con indometacina).

La GGT contribuye al catabolismo extracelular del glutatión (GSH), ya que cataliza la transferencia de la fracción gamma-glutamil del GSH conjugado a aceptores como aminoácidos y dipéptidos. También descompone el GSH en sus aminoácidos constitutivos y, por lo tanto, proporciona la síntesis de novo de cisteína del aminoácido limitante de la velocidad de GSH40. Los niveles de GGT en suero están determinados por varios factores, como la inflamación, la enfermedad hepática alcohólica, las enfermedades de la vesícula y del tracto biliar, el contenido de lípidos/lipoproteínas en plasma, la hipertensión, la hiperuricemia, la diabetes y diversos medicamentos40,41. Los resultados del ensayo de actividad de GGT en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en la Fig. 9c. Se vio que hubo diferencia significativa (P ≤ 0,05) en el contenido de GGT entre todos los grupos. El grupo con colitis inducida sin ningún tratamiento registró el mayor contenido (13,32 nmol/unidad/mL). El contenido tanto en el grupo tratado con SAPE (5,21 nmol/unidad/ml) como en el grupo tratado con indometacina (6,39 nmol/unidad/ml) fue superior al del grupo de control (2,16 nmol/unidad/ml). Alternativamente, las GST son importantes enzimas de desintoxicación de fase II que catalizan la conjugación de sustratos electrofílicos a GSH, y también tienen otras funciones como actividades de peroxidasa e isomerasa, protección de las células contra la muerte celular inducida por H2O2 y unión no catalítica de ligandos endógenos y exógenos. . Dan como resultado la formación de conjugados de GSH, que finalmente son eliminados por varios mecanismos de transporte, como la bomba GS-X dependiente de ATP, entre otros42,43. Los resultados del ensayo de la actividad de GST en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en la Fig. 9d. Se observó una diferencia significativa (P ≤ 0,05) en la actividad de GST entre todos los grupos. El grupo de control registró la actividad más baja (0,17 µmol/mL/min), mientras que el grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento mostró la actividad más alta (0,29 µmol/mL/min). Sin embargo, la actividad fue mayor en el grupo tratado con SAPE (0,26 µmol/ml/min) que en el grupo tratado con indometacina (0,24 µmol/ml/min). La inducción de GGT y GST en las células se produce como una adaptación protectora frente a los oxidantes que se producen durante el metabolismo normal o si aumenta el estrés oxidativo por algún factor como la presencia de ROS44, y los resultados obtenidos sugieren una reducción del nivel de estrés oxidativo con la Aplicación de SAPE en estado de enfermedad.

Las citocinas son estimuladores de la producción de proteínas de fase aguda que se producen durante los procesos inflamatorios. Estas citocinas asociadas a la inflamación incluyen interleucina-6 (IL-6), IL-1β, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), interferón-γ, factor de crecimiento transformante-β, IL-8, factores estimulantes de colonias y factores de crecimiento. . La pleiotropía funcional y la redundancia son rasgos característicos de estas citocinas45,46. El TNF-α es una citoquina proinflamatoria involucrada en la respuesta inmune innata47. Los macrófagos son los principales productores de TNFα y, a nivel celular, regulan una serie de funciones celulares críticas, incluida la supervivencia celular, la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis, que están mediadas por los dos receptores transmembrana, TNF-R1 y TNF-R2. En general, el TNFα generalmente no provoca la muerte celular, pero promueve la transcripción génica y la activación celular9,48. En condiciones de enfermedad, la producción de TNFα y la señalización del receptor de TNF regula muchas facetas de la función de los macrófagos. Desempeña un papel fundamental en la orquestación de la producción de una cascada de citocinas proinflamatorias en muchas enfermedades inflamatorias como la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, la aterosclerosis, la sepsis, la psoriasis, la diabetes y la obesidad. Es uno de los mediadores tempranos más abundantes en el tejido inflamado, ya que se libera rápidamente después de un traumatismo, infección o exposición a LPS48 derivado de bacterias. Los resultados del ensayo del contenido de TNF-α en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en la Fig. 9e. El contenido de TNF-α fue más bajo en el grupo de control (7,65 pg/mL). El contenido de TNF-α en los grupos tratados con SAPE (14,66 pg/mL) e indometacina (13,75 pg/mL) fue menor que el grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento (22,28 pg/mL).

La IL-6 es una citocina pleiotrópica producida en el sitio de la inflamación y desempeña un papel clave en la respuesta de fase aguda, la regulación de las respuestas inmunitarias y la hematopoyesis49. También participa en la regulación de procesos metabólicos, regenerativos y neurales. Los cambios de fase aguda reflejan la presencia e intensidad de la inflamación y la IL-6 es el principal estimulador de la producción de la mayoría de las proteínas de fase aguda45. La IL-6 puede ser producida por una variedad de células después de una estimulación, como una infección, un traumatismo o un desafío inmunológico. También se ha encontrado que tiene un papel protector en el modelo de shock séptico LPS-galactosamina en ratones49. Los resultados del análisis del contenido de IL-6 en el extracto de tejido intestinal para diferentes grupos de tratamiento de ratas se muestran en la Fig. 9f. Su contenido fue más bajo en el grupo control (26,91 pg/mL). No hubo diferencias significativas en el contenido entre los grupos tratados con SAPE (90,76 pg/mL) e indometacina (82,83 pg/mL), y ambos revelaron un contenido mucho más bajo que el grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento (109,56 pg/mL). Los resultados de los ensayos de IL6 y TNF-α indicaron claramente una disminución en el nivel de inflamación después del tratamiento con SAPE.

La esterificación selectiva catalizada por Zn(OTf)2 se empleó con éxito para la producción de éster feniletílico del ácido salicílico (SAPE). Se descubrió que este éster no es citotóxico, con efectos antiinflamatorios y antioxidantes prometedores, y los resultados fueron similares a los de los agentes AINE establecidos. El éster exhibió actividad anticancerígena contra las células de cáncer de mama MCF7 a través de la detención del ciclo celular sub-G1, la reducción de MMP, la acumulación de ROS y la inducción de apoptosis y autofagia. Los resultados por primera vez proporcionan una idea del uso de este éster particular como un potencial agente antiinflamatorio y terapéutico contra el cáncer. La investigación adicional que aclare la captación celular y el metabolismo de SAPE ayudaría a corroborar este éster como un AINE.

La muestra de sangre humana para la obtención de células mononucleares de sangre periférica primaria (PBMC) se recolectó voluntariamente en el Centro de Salud de la Universidad de Tezpur, Assam, India. La línea celular de cáncer de hígado humano embrionario (HepG2), la línea celular de adenocarcinoma colorrectal epitelial (CaCo-2) y la línea celular de cáncer de mama epitelial (MCF-7) se obtuvieron del Centro Nacional para la Ciencia Celular (NCCS), Pune, India. Los medios para el cultivo de células animales se adquirieron de HiMedia, India y los productos químicos y disolventes se obtuvieron de Sigma Aldrich, EE. UU. y Merck, Alemania.

Se añadió ácido salicílico (1,0 equiv) en atmósfera de N2 a una solución en agitación de I2 (2,0 equiv) y trifenilfosfina (2,0 equiv) en acetonitrilo seco (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó con vórtex durante 10 min, y luego Zn(OTf) 2 (5 mol %) se añadió. Se continuó agitando durante 30 min a 60 °C y luego se añadió alcohol feniletílico (1,1 equivalentes) en acetonitrilo seco. Una vez completada la reacción (controlada por TLC), la mezcla se enfrió a 30ºC y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con NaHCO3 saturado seguido de solución de salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. La cromatografía en columna con gel de sílice y un sistema de gradiente de disolvente de acetato de etilo a hexano produjo el compuesto objetivo50 y se validó como se menciona en la sección "Estudio de RMN y FTIR para la validación estructural de SAPE".

Los estudios de RMN de 13C y 1H se realizaron en un espectrofotómetro de RMN (ECS-400, JEOL, Japón) y el software utilizado para la adquisición de datos fue Delta, Ver. 4.3.6. Los compuestos de prueba se disolvieron en cloroformo de grado RMN y la intensidad de campo se fijó en 9,389766 [T] (400 MHz). Las lecturas de FTIR se tomaron en un espectrofotómetro FTIR (Spectrum 100, Perkin Elmer, EE. UU.). Los datos se recopilaron en el modo de absorbancia (A) y el rango de longitud de onda seleccionado fue de 4000 a 400 cm−1. La resolución y el número de escaneos por muestra fueron 4 cm−1 y 4, respectivamente.

Para la simulación de acoplamiento molecular, la estructura de SAPE, indometacina e ibrupofeno se generaron utilizando ChemOffice 2010 (Cambridge Soft, Massachusetts, EE. UU.). Luego, los compuestos se convirtieron a formato 3D para simulaciones de acoplamiento y sus geometrías se optimizaron utilizando métodos de campo de fuerza MM251 y se guardaron como sybyl mol2. Las pruebas in silico ADME-Tox relacionadas con SAPE se realizaron mediante el software ACD/Labs I-Lab 2.0 (Advanced Chemistry Development Inc, Toronto, Canadá).

El acoplamiento molecular de SAPE y otros dos agentes antiinflamatorios establecidos, a saber, indometacina e ibrupofeno, se realizó contra COX-2 (PDB ID: 4PH9) utilizando Molegro Virtual Docker (MVD) 6.01 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca). Se usó un algoritmo de predicción de cavidades basado en rejilla empleando una rejilla discreta de 0,8 Å de resolución para cubrir la proteína, seguido de la colocación de una esfera de 1,4 Å de radio. Se comprobó la esfera en busca de superposiciones con otras esferas y las cavidades encontradas se clasificaron según su volumen21. Para las simulaciones de acoplamiento, el enlace y la cadena lateral se establecieron con una tolerancia de 1,7 y una fuerza de 0,7 y el umbral de desviación cuadrática media (RMSD) para las poses de grupos múltiples se estableció en 2,00 Å. El algoritmo de acoplamiento se estableció en 1500 iteraciones máximas, 50 tamaños de evolución simplex y 100 ejecuciones mínimas para cada compuesto. Las poses moleculares se clasificaron sobre la base de la puntuación de MolDock y Rerank, se visualizaron y se seleccionaron los mejores resultados de acoplamiento para el análisis de interacción ligando-proteína.

Se llevaron a cabo estudios de simulación MD para los mejores golpes de acoplamiento contra el complejo acoplado proteína-ligando. La topología del ligando y las cargas de los átomos se generaron utilizando el servidor PRODRG52, por lo que el valor de la carga se fijó al máximo mientras que la quiralidad se fijó en el valor predeterminado sin más minimización de energía. Los sistemas se procesaron utilizando el campo de fuerza Gromos 43a1 en el que el sistema proteína-ligando se sumergió en agua y las energías se minimizaron, seguido de NVT (canónico) y NPT (isotérmico-isobárico) de equilibrio. Las estructuras equilibradas se sometieron a una simulación MD de 20 ns, y la trayectoria se analizó y trazó para la columna vertebral de RMSD.

Se exportó la conformación de la mejor pose de acoplamiento SAPE y se realizaron los cálculos de DFT utilizando Gaussian 09. Los cálculos teóricos se realizaron en Ground State utilizando el conjunto base DFT/B3LYP/6–31. El método de conjetura se estableció como Huckel extendido con una mezcla de orbitales HOMO y LUMO. Las energías de los orbitales moleculares se consideraron para calcular la brecha de energía de la banda ΔELUMO-HOMO.

El permiso del comité de ética necesario para el uso de sangre humana se obtuvo del Comité de Ética de la Universidad de Tezpur (TUEC), Universidad de Tezpur, Tezpur (Protocolo n.º DoRD/TUEC/10-14/4361 del 28 de marzo de 2014). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los voluntarios para donar sangre para obtener las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los glóbulos rojos (RBC) necesarios para este experimento. Todas las células se cultivaron en un ambiente estable con 5% de CO2 a 37 °C. Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad y se sembraron en medios RPMI-1640 (3 × 103/200 µl) complementados con FBS al 10 % en placas de 96 pocillos. Las células CaCo-2 se cultivaron en medio MEM que contenía suero bovino fetal al 20 %, las células HepG-2 se cultivaron en medio DMEM y las células MCF-7 se cultivaron en medio MEM que contenía FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de penicilina. estreptomicina L.

Los glóbulos rojos se aislaron de la sangre, se lavaron con PBS (pH 7,4), se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min y luego se resuspendió el 2% de la suspensión de eritrocitos (ES) en solución salina. La mezcla de reacción contenía 100 μL de ES, Triton X-100 al 0,1 % y 25, 50 o 100 μg/mL de SAPE en microplacas de 96 pocillos y se incubó durante 60 min a 37 °C en agitación constante y luego se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos. La liberación de hemoglobina se determinó por análisis fotométrico del sobrenadante a 576 nm. Usó Triton X-100 al 0,1 % (como control positivo) y PBS (como control negativo) para lograr una hemólisis del 100 % y del 0 %, respectivamente53.

Las células PBMC, HepG-2, CaCo-2 y MCF-7 (2 × 103) se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con concentraciones crecientes (25, 50, 100 y 200 µg/mL) de SAPE durante 48 h a 37 °C, 5 % CO2. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 20 µL (5 mg/mL en PBS) de solución de MTT y se incubaron durante 4 ha 37ºC. Después de retirar los medios, las formazonas se disolvieron en DMSO y la densidad óptica se midió a 570 nm. La relación inhibitoria de la viabilidad celular se calculó en relación con las células de control cultivadas en medios sin fármaco54.

El efecto de SAPE sobre la viabilidad de las células MCF-7 también se evaluó mediante el ensayo de exclusión con colorante azul tripano. Las células (2 × 103) se cultivaron con diferentes concentraciones (25, 50 y 100 µg/mL) de SAPE en DMSO al 0,1 % y se incubaron durante 48 h. A continuación, se mezcló un total de 0,2 ml de solución de células tripsinizadas con 0,5 ml de azul de tripano al 0,4 % en PBS y, después de 5 min, se contaron las células teñidas (muertas) y no teñidas (viables) usando un hemocitómetro31.

Los compuestos a saber. Se probó la eficacia de SAPE, ácido salicílico y alcohol feniletílico (25, 50 y 100 µg/mL) para inhibir la producción de COX-2 y se comparó con la indometacina. En el ensayo celular estimulado, las células CaCo-2 se preincubaron en medios MEM como se mencionó anteriormente (sección "Cultivo de células PBMC, HepG-2, CaCo-2 y MCF-7") en presencia y ausencia de los compuestos de prueba. durante 1 h. A continuación, se añadieron lipopolisacáridos (LPS) de Escherichia coli 0111: B4 (10 µg/ml) a la suspensión celular y se incubaron durante 48 h a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de retirar los medios, las células se lavaron con PBS, se añadieron a tampón de extracción de células enfriado con hielo (0,1 g/ml) y se lisaron con un batidor de perlas (607EUR, BioSpec Products, EE. UU.). El sobrenadante del lisado tisular se recogió mediante centrifugación (12 000 × g durante 10 min a 4 °C) y se midió la liberación de Cox-2 utilizando un kit ELISA de COX-2 humano (RAB1034, Sigma-Aldrich, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante y las lecturas se tomaron en un lector de microplacas (GloMax Explorer, Promega, EE. UU.).

Para el ensayo de secuestro directo de COX-2, se utilizó un kit de detección de inhibidores de COX-2 fluorimétrico (MAK399, Sigma Aldrich, EE. UU.). El ensayo se basó en la detección fluorométrica de prostaglandina G2, el producto intermedio generado por la enzima COX. Todos los parámetros del ensayo se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la fluorescencia se midió inmediatamente en modo cinético utilizando un lector de microplacas a λEx = 535 nm/λEm = 587 nm a 25 °C durante 5–10 min. Los valores de CI50 para cada uno de los compuestos se calcularon usando el software CompuSyn (ComboSyn, Inc.).

Se trataron células MCF-7 a 1 × 105 células/pocillo con varias concentraciones (25, 50 y 100 μg/mL) de SAPE. Después de 48 h de incubación, tanto las células adherentes como las flotantes se recogieron mediante tripsinización, se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, se fijaron en metanol al 70 % enfriado con hielo durante la noche a -20ºC y posteriormente se incubaron con yoduro de propidio (20 µg/mL) y ARNasa A (200 µg/mL) durante otros 30 min a 37ºC. Luego se analizó la distribución del ciclo celular mediante un citómetro de flujo (BD FACS LSR III, BD Biosciences, EE. UU.). Finalmente, se determinó el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular mediante el software BD Diva.

Para la detección cuantitativa de la generación de ROS intercelular, se sembraron células MCF-7 a una densidad de 1 × 105 en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 h, seguido de tratamiento con varias concentraciones (25, 50 y 100 μg/mL) de SAPE durante 48 h. Posteriormente, las células se tripsinizaron y lavaron con PBS y se tiñeron con diacetato de dicloroflourecien 25 mM durante 30 min a 37ºC en la oscuridad y los niveles relativos de ROS de las células se cuantificaron mediante FCA 30.

El tratamiento de las células MCF-7, como se mencionó en el apartado anterior "Análisis del ciclo celular", fue seguido de una incubación con 400 μl de Rodamina 123® 50 μM a 37ºC durante 30 min con agitación vertical a intervalos de 5 min. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y la intensidad de fluorescencia de Rhodamine 123® se midió mediante FCA con longitudes de onda de excitación y emisión fijadas en 488 nm y 525–530 nm, respectivamente. Por lo tanto, la intensidad de fluorescencia media (MFI) representa los niveles celulares del potencial de membrana mitocondrial intracelular (MMP) 30.

Como se mencionó en 2.5.1, las células MCF-7 (1 × 105 células/mL) se trataron con varias concentraciones (0, 50 y 100 μg/mL) de SAPE. A continuación, las células se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min a 15 ºC y el sedimento se lavó dos veces con PBS. El precipitado se resuspendió en 50 µL de PBS y de la suspensión, se mezclaron 25 µL con 2 µL de mezcla de naranja de acridina (AO) y bromuro de etidio (EB) (100 µg/mL-1:1) durante 10 min y se mantuvo en una incubadora a 37 °C. A continuación, las células se montaron en un portaobjetos de vidrio con cubreobjetos y se observaron con un microscopio de fluorescencia (Leica DM300, Alemania)30.

Para el análisis cualitativo de la autofagia intracelular mediante microscopía de fluorescencia29, la imagen se logró sembrando las células en una placa de 6 pocillos cargada con cubreobjetos a 1 × 105 células/pocillo. Posteriormente, las células se trataron con SAPE y se procesaron como se indica en 4.6.1. Finalmente, después de lavarlas con PBS, las células se tiñeron con AO, se montaron en un microscopio y las imágenes se capturaron utilizando la configuración de filtro adecuada en un microscopio compuesto (Leica DM3000, EE. UU.).

Posteriormente, como en 2.5.1, las células MCF-7 (1 × 105 células/mL) se trataron con varias concentraciones (0, 50 y 100 μg/mL) de SAPE. Aquí, se eliminó el medio y las células se tiñeron con 1 μg/mL de AO a 37 °C durante 15 min, seguido de lavado con PBS e inmediatamente analizado por FCA.

Esto se hizo de acuerdo con Olive y Banáth32. Brevemente, se mezclaron 0,4 mL de células MCF-7 (2 × 104 células/mL) con 1,2 mL de agarosa al 1 % a 40 °C, y 1,2 mL de esta suspensión de células se asentaron sobre la superficie cubierta de agarosa de un recipiente previo. portaobjetos recubierto (1% de agarosa). A continuación, los portaobjetos se sumergieron suavemente en solución de lisis (sarcosilo al 2 %, Na2EDTA 0,5 M y proteinasa K 0,5 mg/ml, pH 8,0) a 4 ºC y se incubaron a 37 ºC durante 20 h en la oscuridad. Luego se sumergió en solución tampón de electroforesis (pH 8,5) durante 30 min y se sometió a electroforesis en el mismo tampón durante 25 min. La tinción se realizó con 2,5 µ/mL de yoduro de propidio en agua destilada y las células se analizaron (50 imágenes de cometas por portaobjetos) usando el software Open Comet examinando imágenes de cometas individuales para el área del cometa y la longitud de la cola del cometa.

Los estudios en animales se realizaron con ratas albinas (Rattus norvegicus de la variedad Wistar) en el Laboratorio de Investigación de Defensa, Tezpur (Número de registro CPCSEA: 1127/bc/07/CPCSEA), Assam. El permiso del comité ético necesario para realizar los estudios con animales se obtuvo del Comité Ético Animal Institucional (IAEC), Defense Research Laboratory, Tezpur (Protocolo n.º 01/mayo/2016 de fecha 03/06/2016). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Además, el informe de los estudios con ratas siguió las recomendaciones establecidas en las pautas ARRIVE.

Las ratas (2 meses de edad) se alojaron en (20 ± 1) °C, (60 ± 5) % de humedad relativa y ciclo de luz/oscuridad (12 h:12 h) en condiciones de barrera libres de patógenos específicos. La dieta para roedores y el agua se administraron ad libitum. Se utilizó un modelo de pretratamiento de administración de fármacos y se dividieron en cinco grupos de manera aleatoria con igual número de hombres y mujeres. Grupo RG-CI: grupo inducido por colitis sin ningún tratamiento (n = 8); Grupo RG-CF: grupo control libre de colitis sin ningún tratamiento (n = 8); Grupo RG-SP: grupo inducido por colitis tratado con SAPE (n = 8); Grupo RG-IM: grupo inducido por colitis tratado con indometacina (n = 8) y RG-PO: grupo modelo inducido por edema de la pata (n = 8).

Se indujo edema de la pata en un grupo diferente de ratas (n = 8) mediante la inyección de 0,15 ml de carragenina al 0,1 % en la región subplantar justo debajo del maléolo lateral de ambas patas izquierdas. A continuación, se administraron SAPE e indometacina (10 mg/kg de peso corporal) por vía transdérmica. El volumen de la pata se midió a las 0, 1, 3 y 5 h mediante un pletismómetro digital (Orchid Scientific, India) y el % de edema se expresó según Upadhyay et al.55.

Desde el día 1 hasta el día 16, se administró SAPE e indometacina a todos los miembros de los respectivos grupos (Grupo RG-SP y RG-IM) en dosis de 250 mg y 1,5 mg, respectivamente, por kg de peso corporal. Después de transcurridas 4 h de la última dosis, las ratas del grupo RG-CI, RG-SP y RG-IM fueron desafiadas con inyección intraperitoneal de LPS de Escherichia coli 0111: B4 a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal. Todas las ratas fueron sacrificadas después de 24 h de desafío con LPS por asfixia con CO2. Post mortem, el colon y el intestino delgado se diseccionaron y se enjuagaron con 1 × PBS frío que contenía penicilina/estreptomicina (100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) con un cóctel inhibidor de proteasa, y luego se abrieron longitudinalmente y se lavaron extensamente con PBS. Se recogieron segmentos intestinales (0,5–1,0 cm), a 2 cm del ano, y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. Los tejidos se almacenaron en tubos libres de pirógenos/endotoxinas y se mantuvieron congelados a –80 °C antes del análisis.

Los pesos corporales de todas las ratas se registraron todos los días antes del tratamiento y se calculó la tasa de ganancia de peso corporal. Las puntuaciones del DAI se calcularon sumando las puntuaciones combinadas de pérdida de peso, consistencia de las heces y sangrado fecal, y dividiendo esta suma por 356.

Los tejidos se fijaron con glutaraldehído al 3%, se lavaron con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se fijaron de nuevo con tetróxido de osmio al 0,1% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M. La deshidratación se realizó en series de 30 a 100 % de acetona, seguida de secado en tetrametilsilano a 4 °C. Las microestructuras se investigaron utilizando un microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM-6390LV, SEM, Oxford) con aumentos de 500 × y 1000 × y un voltaje de aceleración de 20 kV.

El nivel de peroxidación lipídica se expresó como la cantidad de malondialdehído (MDA) formado, y esto se analizó utilizando un kit de ensayo de peroxidación lipídica (MAK085, Sigma-Aldrich, EE. UU.) que utiliza una curva estándar de MDA que oscila entre 0 y 20 nmoles. . El contenido de catalasa (CAT) se determinó utilizando un kit de ensayo de catalasa (A22180, Invitrogen, EE. UU.), y la concentración de catalasa se calculó a partir de una curva estándar de catalasa (0 a 4,0 U/mL) en la que se definió 1 unidad de enzima como la cantidad que descompondrá 1,0 μmol de H2O2 por minuto a pH 7,0 y 25 °C de temperatura. El ensayo de actividad de γ-glutamiltransferasa (GGT) se realizó utilizando un kit de ensayo de GGT (MAK089, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y una curva estándar de pNA (0 a 40 nmol/pocillo), donde una unidad de GGT se definió como la cantidad de enzima que generará 1,0 µmol de pNA por minuto a 37 °C. El ensayo de actividad de glutatión S-transferasa (GST) se realizó con el kit de ensayo GST (CS0410, Sigma-Aldrich, EE. UU.), y la actividad específica de GST se calculó con un coeficiente de extinción molar de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno Conjugado (CDNB)-GST.

Los tejidos se homogeneizaron mediante sonicación con tampón RIPA y PMSF 1 mM. El lisado se centrifugó a 13 000 × g y el sobrenadante se diluyó de 1:10 a 1:100 veces con tampón diluyente estándar antes del análisis. El ensayo de interleucina 6 (IL-6) se realizó con el kit ELISA de IL-6 de ratón (KMC0061, Invitrogen, EE. UU.) y una curva estándar de IL-6 Ms (0–250 pg/mL). El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) se analizó utilizando el kit ELISA de TNF-α de ratón (KMC3011, Invitrogen, EE. UU.) y una curva estándar de Ms TNF-α (7,8–250 pg/mL).

Todos los resultados se presentaron como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA siguiendo la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró que un valor de P < 0,001, P < 0,01 y P < 0,05 indicaba una diferencia significativa entre los grupos.

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Los autores agradecen debidamente la ayuda recibida del Director, Defense Research Laboratory, Assam, India y también del Profesor Anand Ramteke, Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Universidad de Tezpur, Assam, India por permitirnos realizar experimentos con animales y estudios de líneas celulares, respectivamente. .

Departamento de Ingeniería y Tecnología de Alimentos, Universidad de Tezpur, Tezpur, Assam, India

Arup Jyoti Das y Sankar Chandra Deka

Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Universidad de Tezpur, Tezpur, Assam, India

Dinero Kumar Das & Salam Pradeep Singh

Departamento de Química, NN Saikia College, Titabar, Assam, India

Partha Pratim Saikia

Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Jawaharlal Nehru, Nueva Delhi, India

Neelu Singh y Paulraj Rajamani

División de Tecnología Farmacéutica, Laboratorio de Investigación de Defensa, Tezpur, Assam, India

Johirul Islam y Pronobesh Chattopadhyay

Departamento de Física, Universidad de Tezpur, Tezpur, Assam, India

Aftab Ansari

Departamento de Materiales y Ciencias de la Vida, Instituto de Ciencia y Tecnología de Shizuoka, Fukuroi, Japón

Tatsuro Miyaji

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AJD y PPS hicieron la conceptualización; AJD, SPS, MKD y AA formularon la metodología y realizaron el análisis e investigación formal; PR y NS supervisaron los estudios de líneas celulares en JNU, Delhi; JI y PC supervisaron los experimentos relacionados con animales en DRL, T.; SCD y TM realizaron la disponibilidad de recursos y supervisaron toda la obra; AJD y SCD realizaron la redacción, es decir, la preparación del borrador original y todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Sankar Chandra Deka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Recibido: 26 Agosto 2021

Aceptado: 18 abril 2022

Publicado: 24 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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