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Apr 28, 2023

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Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17209 (2022) Citar este artículo

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Miles de millones de células mueren en el cuerpo todos los días, y las partículas de cromatina libres de células (cfChP) que se liberan ingresan a los compartimentos extracelulares del cuerpo, incluida la circulación. Se sabe que los cfChP ingresan fácilmente en las células sanas para dañar su ADN y activar las vías apoptóticas e inflamatorias. Hemos planteado la hipótesis de que el asalto de por vida a las células sanas por parte de las cfChP es la causa subyacente del envejecimiento, y que el envejecimiento podría retrasarse mediante la desactivación de las cfChP extracelulares. Este último puede ser efectuado por los radicales de oxígeno que se generan al mezclar los nutracéuticos resveratrol y cobre (R-Cu). El presente estudio investigó si la administración prolongada de R-Cu retrasaría las características biológicas del envejecimiento. Los ratones C57Bl/6 se dividieron en 3 grupos iguales; un grupo fue sacrificado a la edad de 3 meses, y que actuó como controles jóvenes. Se permitió que los ratones restantes envejecieran y, a la edad de 10 meses, al grupo de envejecimiento experimental se le administró R-Cu por sonda oral dos veces al día durante 12 meses más a una dosis de 1 mg/kg de R y 0,1 μg/kg de Cu. El grupo de control de edad recibió agua por sonda oral dos veces al día durante 12 meses. Los animales de ambos grupos fueron sacrificados a la edad de 22 meses. El tratamiento con R-Cu condujo a la reducción de varias características biológicas del envejecimiento en las células cerebrales, que incluían el desgaste de los telómeros, la deposición de amiloide, el daño en el ADN, la apoptosis, la inflamación, la senescencia, la aneuploidía y la disfunción mitocondrial. El tratamiento con R-Cu también condujo a una reducción significativa de los niveles sanguíneos de glucosa, colesterol y proteína C reactiva. Estos hallazgos sugieren que los cfChP pueden actuar como instigadores globales del envejecimiento y la neurodegeneración, y que el uso terapéutico de R-Cu puede ayudar a que el envejecimiento saludable sea un objetivo alcanzable.

Con una longevidad cada vez mayor, la raza humana se enfrenta a un aumento paralelo de los trastornos degenerativos relacionados con el envejecimiento que pueden comprometer gravemente la calidad de vida. Se prevé que, a nivel mundial, el número de personas de 60 años o más crecerá un 38 %, de 1 000 millones a 1 400 millones, superando en número a los jóvenes durante los próximos diez años1. La Asamblea General de las Naciones Unidas ha declarado 2021-2030 como la Década del Envejecimiento Saludable, con el objetivo final de encontrar intervenciones terapéuticas que retrasen simultáneamente las muchas condiciones asociadas con el envejecimiento1,2. Se argumenta que el envejecimiento saludable debe ser considerado como la última medicina preventiva3. El envejecimiento se caracteriza por una miríada de procesos patológicos que conducen al deterioro gradual de la estructura y función de todas las células y tejidos del cuerpo4, y está asociado con una multitud de trastornos degenerativos como la enfermedad de Alzheimer5, las enfermedades cardiovasculares6, la diabetes7 y el cáncer8. Aunque se han propuesto muchas teorías sobre el envejecimiento9,10, ninguna puede explicar de forma exhaustiva los numerosos cambios que acompañan a este proceso multidimensional.

El daño del ADN y la inflamación crónica son dos características cardinales del envejecimiento11,12. En este contexto, hemos informado que las partículas de cromatina libres de células (cfChP) que se liberan de los miles de millones de células que mueren en el cuerpo todos los días y entran en los compartimentos extracelulares del cuerpo, pueden ser fácilmente internalizadas por células sanas en las que infligen roturas de dsDNA, activan vías apoptóticas e inducen citocinas inflamatorias13,14. Esto nos ha llevado a plantear la hipótesis de que el asalto repetido de por vida a las células sanas por parte de las cfChP puede ser la causa subyacente del envejecimiento15,16. Nuestro grupo ha aislado y caracterizado con éxito cfChP del suero humano, que tras el examen EM reveló una gran heterogeneidad de tamaño que oscila entre ~ 10 y ~ 1000 nm13. También hemos informado que los niveles sanguíneos de cfChP aumentan con la edad17.

Nuestros estudios preclínicos han llevado a la identificación de una nueva combinación prooxidante de los nutracéuticos resveratrol (R) y cobre (Cu) que desactiva las cfChP por medio de radicales de oxígeno18,19,20. R es un antioxidante bien conocido que ha sido ampliamente investigado por sus beneficios para la salud21. Sin embargo, y sorprendentemente, actúa como prooxidante en presencia de Cu, que también es un nutracéutico ampliamente investigado22. Fukuhara et al.23 fueron los primeros en informar que se generan radicales de oxígeno cuando se mezclan R y Cu. Demostraron que R actúa como un catalizador para reducir Cu (II) a Cu (I), lo que da como resultado la generación de radicales de oxígeno que escinden el ADN24 del plásmido pBR322. Hemos ampliado estos hallazgos para demostrar que una combinación de R y Cu puede degradar el ADN genómico y el ARN25 y puede desactivar las cfChP in vivo al degradar su componente de ADN18,19,20,25. Además, hemos observado que, paradójicamente, la actividad degradante del ADN de R-Cu aumenta a medida que la concentración molar de Cu se reduce gradualmente con respecto a R25. Sobre la base de este hallazgo, en el presente estudio mantuvimos la relación molar de R:Cu en 1:10–4.

Hemos informado que una combinación de R y Cu, cuando se usa en una proporción molar de 1:10–4, tiene efectos terapéuticos en varias condiciones preclínicas asociadas con niveles extracelulares elevados de cfChPs18,19,20. Por ejemplo, el R-Cu administrado por vía oral puede mejorar los efectos secundarios tóxicos de la quimioterapia18 y la radioterapia19, y prevenir la tormenta de citoquinas inducida por endotoxinas bacterianas y la muerte en ratones20. Nuestros primeros resultados también sugieren que R-Cu es terapéuticamente eficaz en humanos. Un estudio observacional mostró que el R-Cu administrado por vía oral a pacientes con Covid-19 grave condujo a una reducción de la mortalidad de casi un 50 %26. También informamos que la mucositis de grado III-IV podría reducirse significativamente mediante la administración oral de R-Cu en pacientes que reciben quimioterapia en dosis altas y trasplante de médula ósea para el mieloma múltiple27. El tratamiento con R-Cu también condujo a una reducción significativa en los niveles sanguíneos de citoquinas inflamatorias en ese estudio.

Los radicales de oxígeno que se generan tras la administración oral de R-Cu aparentemente se absorben en el estómago para tener efectos sistémicos en forma de desactivación/erradicación de cfChPs18,19,20,26,27 extracelular. En el presente estudio, hemos aprovechado la propiedad de desactivación de cfChPs de R-Cu para investigar si la administración prolongada de R-Cu a ratones envejecidos retrasará las características del envejecimiento y la neurodegeneración. La dosis de R utilizada en nuestro estudio fue de 1 mg/kg y la de Cu de 0,1 μg/kg, administrada por sonda oral dos veces al día. Esta dosis de Cu fue 20.000 veces menor, y la de R 5 veces menor, que las que han sido utilizadas en estudios preclínicos para investigar sus propiedades promotoras de la salud por otros investigadores28,29.

Usando microscopía confocal y anticuerpos contra el ADN y la histona, detectamos una gran presencia de cfChP extracelulares en el cerebro de ratones envejecidos, y observamos que los cfChP se desactivaron / erradicaron después de la administración oral prolongada de R-Cu. La desactivación/erradicación de cfChPs se asoció con la regulación a la baja de múltiples características biológicas del envejecimiento en las células cerebrales. A nivel sistémico, el tratamiento con R-Cu condujo a una reducción significativa de los niveles sanguíneos de glucosa, colesterol y proteína C reactiva. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los cfChP actúan como instigadores globales del envejecimiento y la neurodegeneración, y que el uso terapéutico de R-Cu puede ayudar a que el envejecimiento saludable sea un objetivo alcanzable.

El protocolo experimental de este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del Centro Avanzado para el Tratamiento, Investigación y Educación sobre el Cáncer (ACTREC), Tata Memorial Centre, Navi Mumbai, India con el permiso No.16/2015. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de seguridad animal de la IAEC y con las de las directrices ARRIVE.

ACTREC- IAEC mantiene el trato, cuidado y uso respetuoso de los animales en la investigación científica. Pretende que el uso de animales en investigación contribuya al avance del conocimiento siguiendo las necesidades éticas y científicas. Todos los científicos y técnicos involucrados en este estudio han recibido capacitación en manejo y manejo ético de animales bajo la supervisión de un veterinario certificado por FELASA. Los animales fueron sacrificados en puntos de tiempo apropiados bajo una atmósfera de CO2 por dislocación cervical bajo la supervisión del personal capacitado de las instalaciones para animales de FELASA.

Las fuentes de R y Cu fueron: Resveratrol (nombre comercial: TransMaxTR, Biotivia LLC, EE. UU. (https://www.biotivia.com/product/transmax/); cobre (nombre comercial: cobre quelado, JR Carlson Laboratories Inc. EE. UU. (https://carlsonlabs.com/chelated-copper/).

Los ratones C57Bl/6 consanguíneos obtenidos de la instalación animal institucional se mantuvieron siguiendo los estándares de nuestro comité de ética animal institucional. Se alojaron en jaulas libres de patógenos que contenían lechos de cáscaras bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a agua y alimentos. El sistema HVAC se utilizó para proporcionar temperatura ambiente, humedad y presión de aire controladas.

El estudio constaba de 24 ratones C57Bl/6, 12 de los cuales eran machos y 12 hembras. Se sacrificaron cuatro ratones de cualquier sexo cuando tenían 3 meses de edad y actuaron como controles jóvenes. A los 16 ratones restantes (8 machos y 8 hembras) se les permitió envejecer hasta los 10 meses y se dividieron en dos grupos: (1) ratones de control de envejecimiento (N = 4 de cada sexo) y (2) ratones tratados con R-Cu ratones envejecidos (N = 4 de cada sexo). Los animales de ambos grupos se sacrificaron a los 12 meses cuando tenían 22 meses.

R-Cu se administró dos veces al día por sonda oral durante 12 meses (de 10 a 22 meses) a una dosis de 1 mg/kg de R y 0,1 μg/kg de Cu. El R, al ser insoluble en agua, se administró como suspensión acuosa (100 μL) y el Cu como solución acuosa (100 μL). Los ratones de control de envejecimiento recibieron agua (100 μL) dos veces al día por sonda oral. Nuestros estudios anteriores han demostrado que esta dosis de R-Cu es terapéuticamente efectiva en muchas otras condiciones preclínicas18,19,20.

La reducción de la actividad física y la pérdida de peso de los ratones se utilizaron como criterios de valoración humanitarios del estudio y se puntuaron dos veces por semana. En puntos de tiempo apropiados como se indicó anteriormente, se recogió sangre por vía retroorbital bajo anestesia con isoflurano para la separación del suero. Luego, los animales fueron sacrificados bajo una atmósfera de CO2 por dislocación cervical bajo la supervisión del personal capacitado de las instalaciones para animales de FELASA. Después de la eutanasia, se extrajo el cerebro de todos los animales, se fijó en formalina al 10 % y se prepararon bloques de parafina para su posterior análisis.

Los detalles de las fuentes comerciales y los números de catálogo de los reactivos, anticuerpos y kits analíticos utilizados en este estudio se proporcionan en la tabla complementaria 1.

La expresión de SOD en las células cerebrales se estimó utilizando la técnica de inmunofluorescencia (IF) como describimos anteriormente18,20. Brevemente, las secciones FFPE se desparafinizaron, se rehidrataron en series de alcohol, se incubaron en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) a 95 °C durante 20 min y se lavaron en PBS 1X. Las secciones se inmunoteñeron usando el anticuerpo primario contra SOD y el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 1 complementaria). Las imágenes se adquirieron y analizaron utilizando el software FISH view versión 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel).

La actividad de SOD en suero se midió mediante ELISA utilizando un kit comercial (Cell Biolabs, CA, EE. UU.; nº de catálogo STA 340) según las instrucciones del fabricante.

La inmunotinción para ADN e histona H4 seguida de microscopía confocal se realizó en secciones de cerebro fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE) como se describió en detalle anteriormente por nosotros20. Se registró la intensidad de fluorescencia de cinco campos confocales elegidos al azar (~ 50 células en cada campo) y se estimó la intensidad de fluorescencia media (MFI) (± SEM).

La longitud media de los telómeros del tejido cerebral se estimó utilizando una técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) altamente sensible30,31. El ADN genómico se aisló del tejido cerebral utilizando el kit DNeasy blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania). La cuantificación del ADN se realizó con un espectrofotómetro Nanodrop™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.). Se usaron diez nanogramos de ADN en 5 µl de 1 × SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.), 250 nM de ambos cebadores específicos de telómero o 350 nM de cebadores 36B4 hasta un volumen total de 10 µl de reacciones. Las condiciones del ciclo térmico tanto para Telómero como para 36B4 son: desnaturalización inicial de 95 °C durante 10 min seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. La secuencia para los cebadores directos e inversos específicos de telómeros (Sigma-Aldrich) es 5' CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT 3' y 5' GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT 3 '. Las secuencias para los cebadores directos e inversos específicos de la fosfoproteína ribosomal ácida (36B4) son 5′ ACT GGT CTA GGA CCC GAG AAG 3′ y 5′TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT 3′, respectivamente). El ADN genómico aislado del bazo de un ratón individual se usó como ADN de referencia y se diluyó en serie para PCR de telómero y 36B4. Todas las muestras se analizaron por duplicado en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 12 K Flex (ThermoFisher) utilizando un bloque de 384 pocillos. Se generaron curvas estándar y se calculó la cantidad de entrada relativa tanto para telómero como para 36B4. El promedio de la proporción de telómero y 36B4 se informó como la longitud promedio de los telómeros.

El FISH de telómero cuantitativo se realizó utilizando sondas de telómero de ácido nucleico peptídico (PNA) marcadas con Cy3 (tabla complementaria 1). Las secciones FFPE de cerebro se desparafinizaron y deshidrataron en serie en etanol absoluto (70/80/100 %), seguido de recuperación de antígeno en tampón de citrato de sodio (pH 6) a 90 °C en baño de agua y enfriado a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en series de alcohol y se desnaturalizaron a 75 °C durante 6 min. A continuación, las secciones se hibridaron con sondas de telómero de PNA durante la noche a 37 °C. Las sondas no unidas se lavaron con tampón de citrato de sodio (SSC) salino 2X seguido de SSC 4X a 56 °C durante 3 min cada una. Las secciones finalmente se lavaron en tampón de citrato de sodio salino Tween-20 (SSCT) 4X a temperatura ambiente y se montaron en VectaShield DAPI. Las imágenes se adquirieron y analizaron utilizando el sistema Applied Spectral Bio-imaging (Applied Spectral Imaging, Israel). Se adquirieron imágenes de ~ 500 núcleos en interfase utilizando SpotScan Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel) en un modo 3D multicanal con una exposición constante de 1000 ms para Cy3 (telómeros) y 150 ms para DAPI (núcleos) a lo largo de los experimentos. Cada imagen 3D constaba de una pila de 11 planos focales por celda con una distancia de muestreo de 500 nm en la dirección z y 107 nm en la dirección xy. Se desconvolucionaron las imágenes y se estimó el número de telómeros por núcleo utilizando el algoritmo Spot Count en el software SpotView 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel). El número de agregados de telómeros por núcleo se estimó visualmente.

La detección del depósito de amiloide en el cerebro se examinó mediante microscopía confocal en secciones FFPE después de la tinción inmunofluorescente usando un anticuerpo primario contra el β-amiloide y un anticuerpo secundario apropiado (tabla complementaria 1). El BDNF sérico se estimó mediante ELISA utilizando un kit comercial (tabla complementaria 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La expresión de γ-H2AX, caspasa-3 activa y NF-kB se analizó en secciones FFPE de tejido cerebral mediante el método IF estándar utilizando los anticuerpos apropiados (tabla complementaria 1) como lo describimos anteriormente18,20.

La evaluación de biomarcadores de senescencia se realizó en secciones FFPE de tejido cerebral que incluían: (1) colocalización de señales de telómero y γ-H2AX IF usando Immuno-FISH; (2) colocalización de 53BP1 y señales de IF de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (PML-NB); (3) expresión de p16INK4a por IF usando anticuerpos apropiados.

La aneuploidía se evaluó con respecto a los números de cromosomas 7 y 16 mediante FISH utilizando sondas específicas de cromosomas en secciones FFPE de tejidos cerebrales. Las secciones se desparafinaron y deshidrataron en series de alcohol (70-100 %), seguido de la recuperación del antígeno en tampón de citrato de sodio (pH 6) a 90 °C en baño de agua y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Las secciones se hibridaron con sondas de ADN específicas del cromosoma 7 y 16 durante la noche a 37 °C. Las sondas no unidas se lavaron con 2X SSC seguido de 0,4X SSC a 70 °C durante 3 min cada una. Las secciones finalmente se lavaron en 4X SSCT y se montaron en VectaShield DAPI. Las imágenes se adquirieron y analizaron utilizando el sistema Applied Spectral Bio-imaging (Applied Spectral Imaging, Israel). Se contó el número de señales fluorescentes por núcleo, y las señales de más o menos de 2 N se consideraron como evidencia de aneuploidía. Se analizaron cinco campos que contenían ~ 500 núcleos y se calculó el número medio de señales por núcleo.

La disfunción mitocondrial fue analizada por IF en secciones FFPE de tejido cerebral para evaluar la expresión de la proteína transmembrana mitocondrial TOMM20. La estimación de los cambios volumétricos en la expresión de TOMM20 se realizó utilizando el software IMARIS 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG). Se calculó el volumen medio (en planos x-y-z) para 5 imágenes (> 2000 mitocondrias) para cada sección del cerebro.

Los niveles séricos de glucosa y colesterol se estimaron utilizando un instrumento automatizado (Dimension EXL con LM, Siemens). Los niveles de proteína C reactiva (PCR) en suero se midieron utilizando un kit ELISA comercial (tabla complementaria 1) según el protocolo del fabricante.

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 6.0 (https://www.graphpad.com/, GraphPad Software, Inc., EE. UU.). Los resultados de los ratones de control envejecidos se compararon con los controles jóvenes y los ratones tratados con R-Cu envejecidos. Los valores medios (± SEM) para cuatro ratones en cada grupo para ambos sexos se compararon usando la prueba t de Student no paramétrica no pareada, por separado para ambos sexos.

El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del Centro Avanzado de Tratamiento, Investigación y Educación en Cáncer (ACTREC). ACTREC IAEC se adhiere a las directrices ARRIVE. Los experimentos en este estudio se realizaron de conformidad con las pautas ARRIVE (tabla complementaria 2).

Como primer paso, investigamos si el tratamiento oral con R-Cu podría haber provocado la generación de radicales libres en el cerebro. Como era de esperar, los ratones envejecidos mostraron una reducción significativa en los niveles de SOD en las células cerebrales (p < 0,05 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 1). Sin embargo, el tratamiento con R-Cu condujo a un marcado aumento en los niveles de SOD que fueron similares a los detectados en ratones de control jóvenes (p < 0,01 en ratones hembra y macho) (Fig. 1). Este hallazgo sugirió que los radicales de oxígeno aparentemente se generaban in vivo después del tratamiento con R-Cu, y que parecían haber ingresado a las células cerebrales. Este último, en un intento de eliminar los radicales de oxígeno invasores, había activado un mecanismo de defensa antioxidante mediante la regulación positiva de la enzima antioxidante SOD. Cabe señalar, sin embargo, que el método IF que usamos para detectar la expresión de SOD en las células cerebrales no refleja su actividad biológica. Sin embargo, el tratamiento con R-Cu condujo a un aumento en la actividad de la SOD en el suero de ratones envejecidos, restaurándolos a niveles similares a los observados en ratones de control jóvenes (p < 0.01 y p < 0.05 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Suplementario Figura S1). Según el aumento de la actividad de SOD en el suero de los ratones tratados con R-Cu, se puede suponer que la actividad de SOD también aumentó en las células cerebrales.

Pérdida de actividad de SOD en células cerebrales de ratones envejecidos y su restauración mediante tratamiento con R-Cu. Imágenes IF representativas de la expresión de SOD en células cerebrales (panel superior) (barra de escala = 10 µm) y cuantificación de los niveles de SOD expresados ​​como histogramas (panel inferior). Para cada portaobjetos se analizaron 1000 células y se calculó el porcentaje de células positivas para SOD. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. Los valores de los ratones de control jóvenes y los ratones envejecidos tratados con R-Cu se compararon con los de los ratones de control envejecidos, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01.

Se realizó microscopía confocal de secciones FFPE de cerebro de ratón envejecido después de inmunotinción fluorescente con anticuerpos anti-DNA (rojo) y anti-histona (verde). Al superponer imágenes fluorescentes de ADN e histonas, se detectó una gran presencia de cfChP (señales fluorescentes amarillas) en los espacios extracelulares del cerebro de ratones envejecidos (Fig. 2). Los cfChP se eliminaron virtualmente después del tratamiento con R-Cu durante un año. Este hallazgo sugirió indirectamente que los radicales de oxígeno generados en el cerebro del ratón aparentemente habían desactivado/erradicado la profusión de cfChP que estaban presentes en los espacios extracelulares del cerebro del ratón envejecido. Cabe señalar en la Fig. 2 que no todas las señales fluorescentes rojas (ADN) y verdes (histonas) se habían co-localizado estrictamente. Esto puede deberse a la irregularidad de las superficies de corte de las secciones de FFPE que impidieron que los respectivos anticuerpos accedieran a los epítopos de ADN e histonas en cfChP. La cuantificación de MFI de señales de cfChPs fluorescentes amarillas mostró una reducción notable en cfChPs en espacios extracelulares del cerebro envejecido después de un año de tratamiento con R-Cu (p <0.01 en ambos sexos) (Fig. 2).

Presencia copiosa de cfChP en espacios extracelulares del cerebro envejecido y su desactivación/erradicación por tratamiento con R-Cu. Imágenes confocales representativas de secciones FFPE después de la inmunotinción fluorescente con anticuerpos anti-DNA (rojo) y anti-histona, que muestran la co-localización de señales rojas y verdes para generar partículas de color amarillo/blanco que representan cfChP (panel izquierdo). Cuantificación de señales IF amarillas expresadas como histogramas (panel derecho). Se registró la intensidad de fluorescencia de cinco campos confocales elegidos al azar (~ 50 células en cada campo) de cada sección. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. Los valores de los ratones de control jóvenes y los ratones envejecidos tratados con R-Cu se compararon con los de los ratones de control envejecidos, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Los telómeros juegan un papel central en los cambios celulares asociados con el envejecimiento32. El desgaste de los telómeros, la pérdida de los telómeros y la agregación de los telómeros son características cardinales del envejecimiento32,33. Estimamos la longitud de los telómeros en las células cerebrales mediante qRT-PCR y observamos una reducción significativa en la longitud de los telómeros en ratones de ambos sexos (p < 0,0001 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 3A). El tratamiento con R-Cu restauró la longitud de los telómeros en un grado significativo en ratones hembra (p < 0,001), pero no en ratones macho (Fig. 3A). Con respecto al número de señales de los telómeros por célula cerebral, se observó una reducción en ratones envejecidos de ambos sexos (p < 0,01 en ambos sexos), que nuevamente se restauró significativamente después del tratamiento con R-Cu en hembras (p < 0,01) pero no en ratones macho (Fig. 3B, C). Se hizo una observación similar con respecto a la agregación de telómeros, que aumentó significativamente en ratones de ambos sexos envejecidos (p < 0,001 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente), pero se redujo significativamente después del tratamiento con R-Cu solo en ratones hembra (p < 0,01) (Fig. 3B,D). Por lo tanto, en general, con respecto a las anomalías de los telómeros, se encontró que R-Cu es eficaz para restaurar las anomalías de los telómeros en ratones hembra pero no en machos.

Anomalías de los telómeros en las células cerebrales de ratones envejecidos y su prevención mediante el tratamiento con R-Cu. (A) Estimación de la longitud de los telómeros por RT-PCR cuantitativa. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales de ambos sexos, excepto en los ratones hembra tratados con R-Cu en los que N era = 3; (B) Imágenes representativas de telómero FISH (barra de escala = 10 μm). (C) Histogramas que representan el número de telómeros por núcleo estimado por SpotScan Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel). El número medio de señales de telómeros fluorescentes por núcleo de cinco campos elegidos al azar (~ 500 núcleos) se representa en los histogramas. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales cada grupo de ambos sexos; (D) Histogramas que representan agregados de telómeros por núcleo (marcados con puntas de flecha en B). El número medio de agregados de telómeros fluorescentes por núcleo de cinco campos elegidos al azar (~ 500 núcleos) se representa en los histogramas. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales cada grupo de ambos sexos. Los valores de (A,C,D) en controles jóvenes y ratones envejecidos tratados con R-Cu se compararon con los de los controles envejecidos, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

El aumento del depósito de proteína amiloide (Aβ) en los espacios extracelulares de las células cerebrales se asocia clásicamente con la enfermedad de Alzheimer34,35. La microscopía confocal que usa anticuerpos contra β-amiloide detectó un aumento notable de la deposición de amiloide en forma de fibrillas de amiloide en ratones envejecidos. Este último se redujo notablemente después de un año de tratamiento con R-Cu (Fig. 4A, panel de la izquierda). La cuantificación de MFI confirmó el marcado aumento en la deposición de β-amiloide extracelular en el cerebro de ratones envejecidos (p < 0,0001 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente). Un año de tratamiento con R-Cu dio como resultado una reducción significativa del amiloide extracelular en ratones de ambos sexos (p < 0,01 y p < 0,5 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 4A, panel de la derecha).

Aumento de la deposición de β-amiloide en el cerebro envejecido y reducción de BDNF en el suero, los cuales se revierten con el tratamiento con R-Cu. (A) Imágenes confocales representativas del depósito de β-amiloide en el cerebro detectado por IF (panel izquierdo). Histogramas cuantitativos que representan valores medios de MFI (± SEM) de fluorescencia de β-amiloide (panel derecho). Para cada diapositiva, se analizó el área del cerebro cubierta por 1000 células. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. (B) Histogramas cuantitativos que representan los niveles medios de BDNF en suero (± SEM). N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos, excepto, hembra de control joven (N = 3), hembra tratada con R-Cu envejecida (N = 3) y ratones macho de control envejecidos (N = 3). Tanto en (A) como en (B), los valores de los controles jóvenes y los animales mayores tratados con R-Cu se compararon con los de los controles mayores, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés), que desempeña un papel importante en la supervivencia y el crecimiento neuronal36, se redujo considerablemente en los sueros de ratones envejecidos de ambos sexos según lo medido por ELISA (p < 0,01 y p < 0,05 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Figura 4B). El tratamiento con R-Cu durante un año revirtió los niveles séricos de BDNF casi a los observados en ratones jóvenes en ambos sexos (p < 0,05 y p < 0,001 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 4B).

A continuación, examinamos varias otras características del envejecimiento, a saber. Daño al ADN, apoptosis e inflamación en células cerebrales37,38,39. El daño del ADN se examinó utilizando la fosforilación de H2AX como marcador de rupturas del ADNds40. Los niveles de γ-H2AX aumentaron notablemente en ratones de edad avanzada (p < 0,001 y p < 0,0001 en ratones hembra y macho, respectivamente). El tratamiento con R-Cu redujo los niveles de γ-H2AX (p < 0,01 y p < 0,05 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 5A, paneles izquierdo y derecho).

Daño en el ADN, apoptosis e inflamación en células cerebrales de ratones envejecidos y su prevención mediante tratamiento con R-Cu. (A) Imágenes representativas de la expresión de γH2AX (barra de escala = 10 µm) (panel izquierdo). Histogramas cuantitativos (panel derecho). Para cada portaobjetos, se analizaron 1000 células y se calculó el porcentaje de células positivas para γH2AX. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. (B) Imágenes representativas de la expresión de caspasa 3 activa (barra de escala = 10 μm) (panel izquierdo). Histogramas cuantitativos (panel derecho). Para cada portaobjetos se analizaron 1000 células y se calculó el porcentaje de células positivas para caspasa-3. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. (C) Imágenes representativas de la expresión de NF-kB (barra de escala = 10 μm) (panel izquierdo). Histogramas cuantitativos (panel derecho). Para cada portaobjetos se analizaron 1000 células y se calculó el porcentaje de células positivas para NF-kB. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. Para (A–C), los niveles en los controles jóvenes y los animales mayores tratados con R–Cu se compararon con los de los controles mayores, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

A continuación, examinamos los niveles activos de caspasa-3, que se sabe que es un marcador de apoptosis mediada por mitocondrias41. Se observó un aumento muy significativo de la apoptosis en las células cerebrales envejecidas en ambos sexos (p < 0,0001). El tratamiento con R-Cu redujo significativamente el grado de apoptosis en ratones de ambos sexos (p < 0,01 y p < 0,0001 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 5B, paneles izquierdo y derecho).

La inflamación es un sello cardinal del envejecimiento12, y evaluamos la expresión del factor de transcripción NF-kB en las células cerebrales. Este último fue significativamente elevado en ratones de edad avanzada de ambos sexos (p < 0,0001). El tratamiento con R-Cu redujo significativamente los niveles de NF-kB en ambos sexos (p < 0,05 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 5C, paneles izquierdo y derecho).

La senescencia es el sello distintivo del envejecimiento biológico caracterizado por el deterioro gradual de las funciones celulares42. Observamos la persistencia de numerosas señales co-localizadoras de γ-H2AX con las de los telómeros (DNA-SCARS), un sello clásico de la senescencia43, en ratones envejecidos de ambos sexos (p < 0,001). La cuantificación de las señales de co-localización reveló una marcada reducción después del tratamiento con R-Cu (p <0.01 en ambos sexos) (Fig. 6A, paneles superior e inferior).

Activación de las características de la senescencia en las células cerebrales de ratones envejecidos y su prevención mediante el tratamiento con R-Cu. (A) Imágenes representativas de inmuno-FISH que muestran la colocalización de señales fluorescentes de γ-H2AX y telómeros (panel superior) (barra de escala = 10 µm). Histogramas de estimación cuantitativa de señales co-localizadas (panel inferior). Para cada portaobjetos, se analizaron 500 núcleos y se calculó el porcentaje de células que mostraban la colocalización de γH2AX y las señales de los telómeros. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. (B) Imágenes IF representativas que muestran la colocalización de señales fluorescentes de 53BP1 y PML (panel izquierdo) (barra de escala = 10 µm). Histogramas de estimación cuantitativa de señales co-localizadas (panel derecho). Para cada portaobjetos, se analizaron 500 núcleos y se calculó el porcentaje de células que mostraban la colocalización de las señales 53BP1 y PML. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. (C) Imágenes representativas de la expresión de p16 (panel superior) (barra de escala = 10 μm) e histogramas cuantitativos (panel inferior). Para cada portaobjetos se analizaron 1000 células y se calculó el porcentaje de células positivas para p16. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. En (A-C), los valores en controles jóvenes y animales envejecidos tratados con R-Cu se compararon con los de los controles envejecidos, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Las roturas de ADN de doble cadena forman un centro de almacenamiento para varias proteínas de unión a heterocromatina en forma de focos heterocromáticos asociados a la senescencia (SAHF)44. Una de estas proteínas de unión a heterocromatina son los cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (PML-NB), que se ha demostrado que están significativamente correlacionados con la senescencia asociada al daño del ADN en ratones envejecidos45,46. Mostramos que el número de señales de co-localización de 53BP1 y PML aumentó notablemente en ratones envejecidos de ambos sexos (p <0.0001). Las señales de colocalización se redujeron significativamente después del tratamiento con R-Cu durante 1 año (p < 0,05 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 6B, paneles izquierdo y derecho).

Otro marcador de senescencia que examinamos fue p16 INK4a 47, que estaba elevado en ratones viejos de ambos sexos (p < 0,0001 para ambos sexos). El tratamiento con R-Cu redujo significativamente los niveles de p16 INK4a (p < 0,05 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 6C, paneles superior e inferior).

La pérdida de telómeros que resulta en la fusión de cromosomas en ratones envejecidos puede causar aneuploidía que resulta en un número anormal de cromosomas48. Examinamos el grado de aneuploidía en las células cerebrales con respecto a los cromosomas 7 y 16, y observamos un aumento de ~ 15 veces en la aneuploidía en ratones envejecidos con respecto a ambos cromosomas (p < 0,0001 para ambos cromosomas en ambos sexos) (Fig. 7 , paneles izquierdo y derecho). El tratamiento con R-Cu redujo notablemente la aneuploidía con respecto a ambos cromosomas en ambos sexos (p < 0,001)) (Fig. 7, paneles de la izquierda y la derecha).

Desarrollo de aneuploidía en células cerebrales de ratones envejecidos y su prevención mediante tratamiento con R-Cu. Imágenes representativas de aneuploidía del cromosoma 7 y el cromosoma 16 en células cerebrales (paneles de la izquierda) (barra de escala = 10 µm). Histogramas cuantitativos que representan el porcentaje de células aneuploides (paneles de la derecha). Se contó el número de señales fluorescentes por núcleo, y las señales de menos de 2 N o más de 2 N en un núcleo se tomaron como evidencia de aneuploidía. Se analizaron cinco campos (~ 500 núcleos) y se calculó el número promedio de señales por núcleo. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. Los valores en los controles jóvenes y los animales mayores tratados con R-Cu se compararon con los de los controles mayores, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

La integridad y la funcionalidad del ADN mitocondrial disminuyen con la edad, lo que resulta en la acumulación de daño oxidativo causado por especies reactivas de oxígeno (ROS)49. Estudiamos la disfunción mitocondrial analizando la expresión de TOMM20, una subunidad codificada en el núcleo del complejo de translocación mitocondrial que importa otras proteínas codificadas en el núcleo. Se informa que su sobreexpresión promueve la neurodegeneración50. Nuestros resultados revelaron una sobreexpresión de TOMM20 en la membrana mitocondrial que conduce a un aumento del volumen mitocondrial total en las células cerebrales envejecidas en comparación con los controles jóvenes (p < 0,001 en ambos sexos). El tratamiento con R-Cu restauró significativamente el volumen mitocondrial (p < 0,05 y p < 0,01 en ratones hembra y macho, respectivamente) (Fig. 8, paneles superior e inferior).

Aumento de la disfunción mitocondrial en ratones envejecidos y su prevención mediante el tratamiento con R-Cu. Imágenes IF representativas que muestran la expresión de TOMM20 (panel superior) (barra de escala = 10 µm). Histogramas cuantitativos que representan cambios de volumen mitocondrial (panel inferior). Se analizaron cinco campos (~ 2000 mitocondrias) y se estimó el cambio volumétrico promedio utilizando el software IMARIS 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG). Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos. Los valores en los controles jóvenes y los animales mayores tratados con R-Cu se compararon con los de los controles mayores, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

El envejecimiento metabólico implica la desregulación de los procesos fisiológicos que conducen a la resistencia a la insulina y la acumulación de lípidos provocada por la inflamación crónica de bajo grado51,52. Como se anticipó, los niveles de glucosa en suero se elevaron significativamente en los ratones envejecidos53 (p < 0,01 para ambos sexos), que se redujeron a los niveles observados en los controles jóvenes después de un año de tratamiento con R-Cu (p < 0,01 para ambos sexos) (Fig. 9A). ). El colesterol sérico se elevó significativamente en los ratones hembra envejecidos (p < 0,05) pero no en los ratones macho (Fig. 9B). El colesterol sérico se elevó significativamente en los ratones hembra envejecidos (p < 0,05) pero no en los ratones macho (Fig. 9B). No obstante, el tratamiento con R-Cu redujo significativamente los niveles de colesterol sérico en ambos sexos (p < 0,001 y p < 0,05 en ratones hembra y macho, respectivamente). La PCR fue muy significativamente elevada en ratones de edad avanzada de ambos sexos (p < 0,0001) y se redujo con el tratamiento con R-Cu (p < 0,05 en ambos sexos) (Fig. 9C).

Aumento de la disfunción metabólica en ratones envejecidos y su prevención mediante el tratamiento con R-Cu. (A–C) representan histogramas de niveles de glucosa sérica, colesterol y PCR, respectivamente. Las barras representan valores medios ± SEM. N = 4 animales en cada grupo de ambos sexos excepto en colesterol hembra joven control (N = 3) y colesterol macho joven control (N = 2). Los niveles en los controles jóvenes y los animales mayores tratados con R-Cu se compararon con los de los controles mayores, y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Las ROS son especies moleculares de vida corta que contienen un electrón desapareado, lo que las hace muy reactivas cuando buscan otro electrón con el que emparejarse y, en el proceso, pueden dañar biomoléculas como el ADN, las proteínas y los lípidos54. Se sabe que el estrés oxidativo inducido por ROS tiene múltiples efectos nocivos en las células huésped55. Sin embargo, hemos informado que, paradójicamente, cuando las ROS se generan artificialmente fuera de la célula en los espacios extracelulares del cuerpo, pueden tener efectos terapéuticos de gran alcance18,19,20,26,27. La mezcla de R con Cu conduce a la generación de radicales de oxígeno en virtud de la capacidad de R para reducir Cu (II) a Cu (I)23,25. Los radicales de oxígeno que se generan en el estómago tras la administración oral de R-Cu aparentemente se absorben para tener efectos sistémicos en forma de desactivación/erradicación de cfChP extracelulares. Hemos demostrado que los cfChP tienen efectos dañinos de gran alcance en las células huésped. Por ejemplo, las cfChP pueden entrar fácilmente en las células sanas para dañar su ADN, activar citocinas inflamatorias y promover la apoptosis a través de la vía mitocondrial13,14. Dado que 1 × 109–1 × 1012 células mueren en el cuerpo todos los días56,57, hemos formulado la hipótesis de que el ataque repetido y de por vida a las células sanas por parte de las cfChP derivadas de las células moribundas puede ser la causa subyacente del envejecimiento15,16. En apoyo de esta hipótesis, mostramos en este artículo que la administración oral prolongada de R-Cu a ratones envejecidos reguló a la baja múltiples características biológicas del envejecimiento y la neurodegeneración en virtud de su capacidad para desactivar las cfChP. Nuestros resultados sugieren que R-Cu puede calificar como un agente antienvejecimiento ideal, ya que tiene el potencial de retardar o retrasar simultáneamente muchas condiciones asociadas con el envejecimiento2. Para ser aplicable a nivel mundial, un agente antienvejecimiento ideal también debe ser económico y no tóxico, los dos criterios que también cumple R-Cu. Este último se puede administrar fácilmente por vía oral, y tanto R como Cu ya están aprobados para uso humano. En la figura 10 se proporciona un resumen ilustrado del diseño del estudio y los mecanismos por los cuales los radicales de oxígeno generados por R-Cu erradican las cfChP del microambiente cerebral, lo que conduce a una regulación a la baja de las características del envejecimiento.

Ilustración gráfica del diseño del estudio y los mecanismos implicados en la regulación a la baja inducida por radicales de oxígeno de las características biológicas del envejecimiento en las células cerebrales después del tratamiento con R-Cu. (A) Los cfChP que se difunden fuera de la circulación, o aquellos que se liberan localmente de las células cerebrales moribundas, son fácilmente internalizados por las células cerebrales sanas, en las que activan múltiples características biológicas del envejecimiento. (B) Los radicales de oxígeno se generan en el estómago tras la administración oral de R-Cu, que se absorben fácilmente y provocan efectos sistémicos en forma de desactivación/erradicación de cfChP en el microambiente cerebral. La desactivación/erradicación de cfChP conduce a la regulación negativa de las características biológicas del envejecimiento en las células cerebrales. Los radicales de oxígeno también entran en las células cerebrales sanas; pero su entrada conduce a la activación de la enzima antioxidante superóxido dismutasa (SOD), que desintoxica y elimina los agentes agresores, protegiendo así el ADN genómico.

El (los) mecanismo (s) por el cual R-Cu regula a la baja las múltiples características biológicas del envejecimiento y la neurodegeneración necesita elaboración. La reversión del acortamiento de los telómeros por parte de R-Cu puede sugerir que el acortamiento de los telómeros podría ser una consecuencia del daño en el ADN infligido por las cfChP que cortan los extremos de los telómeros y hacen que se acorten. Observamos efectos diferenciales entre ratones hembra y macho con respecto a las anomalías de los telómeros. Los efectos de R-Cu en la prevención de anomalías de los telómeros en ratones hembra fueron estadísticamente significativos para todos los parámetros probados, mientras que este no fue el caso en los ratones macho. Queda por determinar la explicación biológica de este hallazgo discrepante. La rotura de los extremos de los telómeros también puede ayudar a explicar nuestra detección de señales persistentes de γ-H2AX en las regiones de los telómeros de las células cerebrales (ADN-SCARS), una firma establecida de senescencia43. Los extremos desnudos de los cromosomas pueden fusionarse entre sí dando lugar a inestabilidad cromosómica y aneuploidía48, tal y como se detectó en nuestro estudio. Con respecto a la disfunción mitocondrial, recientemente informamos que las cfChP internalizadas, además de causar daño al ADN genómico, pueden causar daño físico a las mitocondrias58. Uno de los indicadores de daño mitocondrial detectado en ese estudio fue la regulación positiva de TOMM2058. Nuestro hallazgo en el presente estudio de la sobreexpresión de TOMM20 en ratones envejecidos y su reversión por R-Cu es consistente con la posibilidad de que el daño mitocondrial en ratones envejecidos sea inducido por cfChP que se liberan de las células cerebrales moribundas. Sin embargo, la reducción en la formación de placas de amiloide después del tratamiento prolongado con R-Cu sugeriría un papel desconocido de las cfChP que requiere más investigación. De manera similar, el mecanismo o mecanismos por los cuales R-Cu redujo la disfunción metabólica en ratones envejecidos que conducen a la reducción de los niveles séricos de glucosa, colesterol y CRP siguen siendo desconocidos en la actualidad. En conjunto, se puede concluir que los cfChP tienen efectos pleiotrópicos con amplias implicaciones en el envejecimiento y la neurodegeneración que quedan abiertas a futuras investigaciones.

No detectamos ninguna evidencia de daño al ADN genómico de las células cerebrales que pudiera atribuirse a los radicales de oxígeno que se generan después de un año de tratamiento con R-Cu. La enzima antioxidante SOD marcadamente regulada al alza en ratones tratados con R-Cu aparentemente neutralizó los radicales de oxígeno invasores y evitó el daño al ADN genómico celular (ver Fig. 1). Por lo tanto, la entrada de radicales de oxígeno generados por R-Cu en las células cerebrales conduce a una regulación positiva de SOD, que a su vez protege al genoma del daño oxidativo inducido por ROS. Esto se confirmó aún más por nuestro hallazgo de una reducción en las señales de γ-H2AX en los ratones tratados con R-Cu (ver Fig. 5A). En general, no observamos efectos adversos en ratones a los que se les administró R-Cu durante un período de un año. Esto sugirió que los genomas de todas las células del cuerpo estaban protegidos de manera similar de los efectos potencialmente dañinos de los radicales de oxígeno mediante enzimas antioxidantes reguladas al alza.

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, no aborda los efectos de R-Cu en funciones fisiológicas como la memoria o aspectos del comportamiento de los animales, o si prolonga la supervivencia. Tampoco se investigaron los efectos de detener la exposición a R-Cu; Se desconoce si los cambios observados se revertirían o desaparecerían. El estudio tampoco aborda si el fenómeno de la hormesis está involucrado en los efectos biológicos que observamos59,60. Este tema es particularmente relevante ya que usamos dosis bajas de R y Cu, los cuales han sido reportados como exhibidores de efectos horméticos61,62. Se ha informado que la respuesta exitosa a la terapia con R se debe a sus acciones horméticas: ejerce efectos beneficiosos a dosis bajas y efectos citotóxicos a dosis más altas61. Con respecto al Cu, se ha demostrado que el tratamiento previo de los animales con dosis bajas los protege de dosis letales más altas de Cu62. No proporcionamos evidencia directa de que mezclar R con Cu conduzca a la generación de radicales de oxígeno en virtud de la capacidad de R para reducir Cu (II) a Cu (I). La desactivación de cfChPs en los espacios extracelulares del cerebro que observamos asume que esto es efectuado por radicales de oxígeno; en realidad no demostramos la presencia de radicales de oxígeno en el cerebro del ratón. Sin embargo, nuestro hallazgo de una mayor actividad de SOD en el suero de ratones tratados con R-Cu lleva a suponer que los radicales de oxígeno también podrían haberse generado en el cerebro. Tampoco examinamos el mecanismo por el cual los radicales de oxígeno se absorben en el estómago o si eran reactivos contra las cfChP. Finalmente, observamos que el tratamiento con R-Cu conduce a un aumento en la expresión de SOD en las células cerebrales. Esto no implica necesariamente una mayor actividad de SOD.

Se cree que el envejecimiento es una consecuencia del estrés oxidativo que conduce a la pérdida progresiva de la función de los tejidos y órganos como resultado de la acumulación de daño inducido por ROS63,64. Sin embargo, la terapia antioxidante para retardar el envejecimiento en modelos animales ha producido resultados contradictorios65,66, y los de humanos han sido equívocos67. De todos los antioxidantes, el resveratrol ha sido el más investigado como agente antienvejecimiento68. Nuestros resultados actuales plantean la hipótesis de que los efectos antienvejecimiento informados del resveratrol pueden deberse a su actividad prooxidante en presencia de cobre. Los resultados contradictorios pueden reflejar la disponibilidad inconsistente de cobre en el estómago para que el resveratrol tenga una actividad prooxidante sostenida para desactivar de manera efectiva las cfChP extracelulares y tener un efecto protector contra el envejecimiento.

Demostramos por primera vez que los cfChP derivados de células cerebrales muertas están abundantemente presentes en los espacios extracelulares del cerebro que envejece. También mostramos que los cfChP extracelulares son prácticamente eliminados por los radicales de oxígeno que se generan después del tratamiento prolongado con R-Cu. El hecho de que la eliminación de cfChP se asocie con la regulación a la baja de múltiples características biológicas del envejecimiento y la neurodegeneración constituye un sólido argumento a favor del papel directo de las cfChP en la etiología de estos procesos patológicos. Proponemos que las cfChP liberadas de las células cerebrales moribundas inician un círculo vicioso de más daño en el ADN, apoptosis e inflamación, poniendo en marcha una "tormenta de citoquinas" implacable y de bajo grado69. Proponemos que estos últimos, junto con otros efectos pleiotrópicos nocivos aún desconocidos de las cfChP, son los procesos subyacentes que definen el envejecimiento. Nuestros resultados sugieren que estos efectos nocivos se pueden prevenir mediante la desactivación/erradicación de los cfChP ofensivos a través de radicales de oxígeno. Proponemos que la administración oral de una combinación de pequeñas cantidades de R y Cu promete ser una combinación terapéutica eficaz contra el envejecimiento. Si R-Cu será eficaz para retrasar el envejecimiento y la neurodegeneración en humanos tendrá que esperar ensayos clínicos en poblaciones apropiadas. Cabe señalar en este contexto que nuestros primeros resultados han demostrado que R-Cu es terapéuticamente eficaz en humanos, aunque en relación con otras situaciones patológicas26,27.

Durante los últimos cincuenta años de investigación biogerontológica, se han propuesto muchas teorías y causas del envejecimiento9,10, pero ninguna puede explicar de manera integral la miríada de cambios que acompañan a este proceso multidimensional. Si bien reconocemos que puede haber otros factores en juego, nuestros resultados sugieren que los cfChP pueden ser instigadores globales del envejecimiento y la neurodegeneración, y que el uso terapéutico de R-Cu puede ayudar a que el envejecimiento saludable sea un objetivo alcanzable.

Todos los datos relevantes para la interpretación de los resultados están incluidos en el manuscrito. Los datos sin procesar se pueden encontrar en el repositorio de conjuntos de datos de Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20265906).

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Agradecemos sinceramente al Dr. Snehal Shabrish por preparar la infografía y al Sr. Roshan Shaikh y al Sr. Ashish Pawar por su ayuda en la preparación del manuscrito.

Este estudio fue apoyado por el Departamento de Energía Atómica, Gobierno de la India, a través de su subvención CTCTMC a Tata Memorial Center otorgada a IM. La agencia de financiación no tuvo ningún papel en el diseño de la investigación, la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos y la redacción del manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Kavita Pal y Gorantla V. Raghuram.

Laboratorio de investigación traslacional, Tata Memorial Centre, Centro avanzado para el tratamiento, la investigación y la educación sobre el cáncer, Kharghar, Navi Mumbai, 410210, India

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary e Indraneel Mittra

Instituto Nacional Homi Bhabha, Anushakti Nagar, Bombay, 400094, India

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary e Indraneel Mittra

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KP, GVR, JD, SS, VJ, AS, BR, HT, DK y SC realizaron el experimento. IM, KP y GVR supervisó los experimentos. KP y GVR realizaron análisis de datos. IM conceptualizó el proyecto, fue responsable de la supervisión general y de la obtención de fondos. IM, KP y GVR escribieron el documento. IM aprobó el manuscrito final.

Correspondencia a Indraneel Mittra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Pal, K., Raghuram, GV, Dsouza, J. et al. Una combinación prooxidante de resveratrol y cobre regula a la baja múltiples características biológicas del envejecimiento y la neurodegeneración en ratones. Informe científico 12, 17209 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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Recibido: 30 junio 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 14 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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